生物荧光传感器检测环境水样中氨基甲酸酯类农药残留
于源华等
关键词：氨基甲酸酯类农药； 基因组文库； 生物荧光传感器； 非细胞体系
1引言
氨基甲酸酯类农药是农作物防治虫害的常用农药[1]，常用的如呋喃丹（2，3二氢2，2二甲基7苯并呋喃基甲基氨基甲酸酯）、西维因 （（1萘基）N甲基氨基甲酸酯），它们是主要的氨基甲酸酯类杀虫剂，能被植物的根、茎、叶吸收，并在作物内传导；可经消化道、呼吸道和皮肤被人吸收，吸收后主要分布于肝、肾、脂肪和肌肉中。氨基甲酸酯类农药是一种抑制体内胆碱酯酶的神经毒素，具有潜在致癌、致畸、致突变作用[2～4]。近年来，农药残留和食品安全的问题备受关注。
目前，氨基甲酸酯类农药残留的检测方法主要用于蔬菜和水果等样品，环境水体中氨基甲酸酯类农药残留的快速检测鲜有报道。我国现行氨基甲酸酯类农药国家标准检测方法有色谱法[5，6]、胆碱酯酶抑制法[7]等。色谱法定量准确，但仪器体积大，对检测人员的技术要求高；胆碱酯酶抑制法快速、便捷，但灵敏度低，检出限仅为mg/kg级。因此建立灵敏、简便、低成本的环境水体中氨基甲酸酯类农药残留快速检测方法对环境监测领域意义重大。
近年来，非细胞体系生物荧光传感器以快速、灵敏、高通量的优点，在快速检测领域受到广泛关注。非细胞体系是在细胞抽提物的酶系中合成蛋白质的体外系统，具有稳定、快速、高效等特点[8]。Xiong等[9]将绿色荧光蛋白基因同源重组到睾丸酮丛毛单胞菌中甾体激素特异性响应功能基因下游，构建了定量检测甾体激素的非细胞体系生物荧光传感器，灵敏度达到1.0 ng/L。本研究组在质粒pK18的顺式β半乳糖苷酶启动子基因下游，依次插入了甾体激素及多环芳烃的特异性响应功能基因、绿色荧光蛋白基因，并将质粒转入大肠杆菌BL21中，构建了定量检测甾体激素及多环芳烃的非细胞体系高效生物荧光传感器，灵敏度达到0.1 ng/L[10] 。
本研究通过构建氨基甲酸酯类农药降解菌H5基因组文库，筛选出氨基甲酸酯类农药特异性响应功能基因的调控序列，与增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因连接，构建了检测氨基甲酸酯类农药残留的非细胞体系生物荧光传感器，用于环境水体中的农残检测。当样本中含有氨基甲酸酯类农药时EGFP表达并发光，荧光值在一定范围内与农药含量呈正相关。
2实验部分
2.1仪器与试剂
Synergy2荧光酶标仪（美国BioTek公司）； 96孔微孔黑板（美国Corning公司）； LC20A高效液相色谱仪、 UV2550紫外可见光分光光度计（日本岛津公司）； 5810R冷冻高速离心机（德国Eppendorf公司）； HZQF160全温振荡培养箱（哈东联公司）。
H5菌株（本实验室保存）、质粒pKEGFP2（本实验室构建）；大肠杆菌HB101（北京鼎国生物公司）。
呋喃丹标准品（中国药品生物制品检定所）；LB培养基、无机盐培养基、Kanamycin（北京鼎国公司）；限制性内切酶、碱性磷酸酶（NEB公司）；其它试剂均为分析纯，实验用水为去离子水。
呋喃丹标准液配制：呋喃丹标准品0.01 g，加入10 mL丙酮溶解，再用含有10%丙酮的磷酸盐缓冲液（PBS）将其稀释成所需浓度的呋喃丹标准液。
2.2H5菌株对氨基甲酸酯类农药降解功能的鉴定
配制50 mg/L呋喃丹，作为唯一碳源的无机盐培养基，分别加入HB101菌液和H5菌液，HB101菌液在37 ℃，H5菌液在27 ℃，2000 r/min，培养14 h，高效液相（HPLC）法检测培养基中呋喃丹含量。HPLC条件：ODSC18反向柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇水（70∶30， V/V）；流速1 mL/min；柱温30 ℃；紫外检测器，检测波长210 nm。
2.3H5菌株基因组文库的构建及功能基因调控序列的筛选
参照基因组文库构建方法[11]，用限制性内切酶BamHI酶切H5染色体及载体pKEGFP2，将其连接，转化HB101感受态细胞，Kanamycin 抗性LB固体培养基筛选单克隆。将筛选出的单克隆菌液与10， 100和1000 ng/L呋喃丹标准液在96孔微孔黑板中诱导培养1 h，荧光酶标仪检测荧光强度，激发波长475nm，发射波长509 nm，选取荧光强度与呋喃丹浓度正相关且荧光增强率（FE）最大的克隆子。
关键词：氨基甲酸酯类农药； 基因组文库； 生物荧光传感器； 非细胞体系
1引言
氨基甲酸酯类农药是农作物防治虫害的常用农药[1]，常用的如呋喃丹（2，3二氢2，2二甲基7苯并呋喃基甲基氨基甲酸酯）、西维因 （（1萘基）N甲基氨基甲酸酯），它们是主要的氨基甲酸酯类杀虫剂，能被植物的根、茎、叶吸收，并在作物内传导；可经消化道、呼吸道和皮肤被人吸收，吸收后主要分布于肝、肾、脂肪和肌肉中。氨基甲酸酯类农药是一种抑制体内胆碱酯酶的神经毒素，具有潜在致癌、致畸、致突变作用[2～4]。近年来，农药残留和食品安全的问题备受关注。
目前，氨基甲酸酯类农药残留的检测方法主要用于蔬菜和水果等样品，环境水体中氨基甲酸酯类农药残留的快速检测鲜有报道。我国现行氨基甲酸酯类农药国家标准检测方法有色谱法[5，6]、胆碱酯酶抑制法[7]等。色谱法定量准确，但仪器体积大，对检测人员的技术要求高；胆碱酯酶抑制法快速、便捷，但灵敏度低，检出限仅为mg/kg级。因此建立灵敏、简便、低成本的环境水体中氨基甲酸酯类农药残留快速检测方法对环境监测领域意义重大。
近年来，非细胞体系生物荧光传感器以快速、灵敏、高通量的优点，在快速检测领域受到广泛关注。非细胞体系是在细胞抽提物的酶系中合成蛋白质的体外系统，具有稳定、快速、高效等特点[8]。Xiong等[9]将绿色荧光蛋白基因同源重组到睾丸酮丛毛单胞菌中甾体激素特异性响应功能基因下游，构建了定量检测甾体激素的非细胞体系生物荧光传感器，灵敏度达到1.0 ng/L。本研究组在质粒pK18的顺式β半乳糖苷酶启动子基因下游，依次插入了甾体激素及多环芳烃的特异性响应功能基因、绿色荧光蛋白基因，并将质粒转入大肠杆菌BL21中，构建了定量检测甾体激素及多环芳烃的非细胞体系高效生物荧光传感器，灵敏度达到0.1 ng/L[10] 。
本研究通过构建氨基甲酸酯类农药降解菌H5基因组文库，筛选出氨基甲酸酯类农药特异性响应功能基因的调控序列，与增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因连接，构建了检测氨基甲酸酯类农药残留的非细胞体系生物荧光传感器，用于环境水体中的农残检测。当样本中含有氨基甲酸酯类农药时EGFP表达并发光，荧光值在一定范围内与农药含量呈正相关。
2实验部分
2.1仪器与试剂
Synergy2荧光酶标仪（美国BioTek公司）； 96孔微孔黑板（美国Corning公司）； LC20A高效液相色谱仪、 UV2550紫外可见光分光光度计（日本岛津公司）； 5810R冷冻高速离心机（德国Eppendorf公司）； HZQF160全温振荡培养箱（哈东联公司）。
H5菌株（本实验室保存）、质粒pKEGFP2（本实验室构建）；大肠杆菌HB101（北京鼎国生物公司）。
呋喃丹标准品（中国药品生物制品检定所）；LB培养基、无机盐培养基、Kanamycin（北京鼎国公司）；限制性内切酶、碱性磷酸酶（NEB公司）；其它试剂均为分析纯，实验用水为去离子水。
呋喃丹标准液配制：呋喃丹标准品0.01 g，加入10 mL丙酮溶解，再用含有10%丙酮的磷酸盐缓冲液（PBS）将其稀释成所需浓度的呋喃丹标准液。
2.2H5菌株对氨基甲酸酯类农药降解功能的鉴定
配制50 mg/L呋喃丹，作为唯一碳源的无机盐培养基，分别加入HB101菌液和H5菌液，HB101菌液在37 ℃，H5菌液在27 ℃，2000 r/min，培养14 h，高效液相（HPLC）法检测培养基中呋喃丹含量。HPLC条件：ODSC18反向柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇水（70∶30， V/V）；流速1 mL/min；柱温30 ℃；紫外检测器，检测波长210 nm。
2.3H5菌株基因组文库的构建及功能基因调控序列的筛选
参照基因组文库构建方法[11]，用限制性内切酶BamHI酶切H5染色体及载体pKEGFP2，将其连接，转化HB101感受态细胞，Kanamycin 抗性LB固体培养基筛选单克隆。将筛选出的单克隆菌液与10， 100和1000 ng/L呋喃丹标准液在96孔微孔黑板中诱导培养1 h，荧光酶标仪检测荧光强度，激发波长475nm，发射波长509 nm，选取荧光强度与呋喃丹浓度正相关且荧光增强率（FE）最大的克隆子。
关键词：氨基甲酸酯类农药； 基因组文库； 生物荧光传感器； 非细胞体系
1引言
氨基甲酸酯类农药是农作物防治虫害的常用农药[1]，常用的如呋喃丹（2，3二氢2，2二甲基7苯并呋喃基甲基氨基甲酸酯）、西维因 （（1萘基）N甲基氨基甲酸酯），它们是主要的氨基甲酸酯类杀虫剂，能被植物的根、茎、叶吸收，并在作物内传导；可经消化道、呼吸道和皮肤被人吸收，吸收后主要分布于肝、肾、脂肪和肌肉中。氨基甲酸酯类农药是一种抑制体内胆碱酯酶的神经毒素，具有潜在致癌、致畸、致突变作用[2～4]。近年来，农药残留和食品安全的问题备受关注。
目前，氨基甲酸酯类农药残留的检测方法主要用于蔬菜和水果等样品，环境水体中氨基甲酸酯类农药残留的快速检测鲜有报道。我国现行氨基甲酸酯类农药国家标准检测方法有色谱法[5，6]、胆碱酯酶抑制法[7]等。色谱法定量准确，但仪器体积大，对检测人员的技术要求高；胆碱酯酶抑制法快速、便捷，但灵敏度低，检出限仅为mg/kg级。因此建立灵敏、简便、低成本的环境水体中氨基甲酸酯类农药残留快速检测方法对环境监测领域意义重大。
近年来，非细胞体系生物荧光传感器以快速、灵敏、高通量的优点，在快速检测领域受到广泛关注。非细胞体系是在细胞抽提物的酶系中合成蛋白质的体外系统，具有稳定、快速、高效等特点[8]。Xiong等[9]将绿色荧光蛋白基因同源重组到睾丸酮丛毛单胞菌中甾体激素特异性响应功能基因下游，构建了定量检测甾体激素的非细胞体系生物荧光传感器，灵敏度达到1.0 ng/L。本研究组在质粒pK18的顺式β半乳糖苷酶启动子基因下游，依次插入了甾体激素及多环芳烃的特异性响应功能基因、绿色荧光蛋白基因，并将质粒转入大肠杆菌BL21中，构建了定量检测甾体激素及多环芳烃的非细胞体系高效生物荧光传感器，灵敏度达到0.1 ng/L[10] 。
本研究通过构建氨基甲酸酯类农药降解菌H5基因组文库，筛选出氨基甲酸酯类农药特异性响应功能基因的调控序列，与增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因连接，构建了检测氨基甲酸酯类农药残留的非细胞体系生物荧光传感器，用于环境水体中的农残检测。当样本中含有氨基甲酸酯类农药时EGFP表达并发光，荧光值在一定范围内与农药含量呈正相关。
2实验部分
2.1仪器与试剂
Synergy2荧光酶标仪（美国BioTek公司）； 96孔微孔黑板（美国Corning公司）； LC20A高效液相色谱仪、 UV2550紫外可见光分光光度计（日本岛津公司）； 5810R冷冻高速离心机（德国Eppendorf公司）； HZQF160全温振荡培养箱（哈东联公司）。
H5菌株（本实验室保存）、质粒pKEGFP2（本实验室构建）；大肠杆菌HB101（北京鼎国生物公司）。
呋喃丹标准品（中国药品生物制品检定所）；LB培养基、无机盐培养基、Kanamycin（北京鼎国公司）；限制性内切酶、碱性磷酸酶（NEB公司）；其它试剂均为分析纯，实验用水为去离子水。
呋喃丹标准液配制：呋喃丹标准品0.01 g，加入10 mL丙酮溶解，再用含有10%丙酮的磷酸盐缓冲液（PBS）将其稀释成所需浓度的呋喃丹标准液。
2.2H5菌株对氨基甲酸酯类农药降解功能的鉴定
配制50 mg/L呋喃丹，作为唯一碳源的无机盐培养基，分别加入HB101菌液和H5菌液，HB101菌液在37 ℃，H5菌液在27 ℃，2000 r/min，培养14 h，高效液相（HPLC）法检测培养基中呋喃丹含量。HPLC条件：ODSC18反向柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇水（70∶30， V/V）；流速1 mL/min；柱温30 ℃；紫外检测器，检测波长210 nm。
2.3H5菌株基因组文库的构建及功能基因调控序列的筛选
参照基因组文库构建方法[11]，用限制性内切酶BamHI酶切H5染色体及载体pKEGFP2，将其连接，转化HB101感受态细胞，Kanamycin 抗性LB固体培养基筛选单克隆。将筛选出的单克隆菌液与10， 100和1000 ng/L呋喃丹标准液在96孔微孔黑板中诱导培养1 h，荧光酶标仪检测荧光强度，激发波长475nm，发射波长509 nm，选取荧光强度与呋喃丹浓度正相关且荧光增强率（FE）最大的克隆子。
关键词：氨基甲酸酯类农药； 基因组文库； 生物荧光传感器； 非细胞体系
1引言
氨基甲酸酯类农药是农作物防治虫害的常用农药[1]，常用的如呋喃丹（2，3二氢2，2二甲基7苯并呋喃基甲基氨基甲酸酯）、西维因 （（1萘基）N甲基氨基甲酸酯），它们是主要的氨基甲酸酯类杀虫剂，能被植物的根、茎、叶吸收，并在作物内传导；可经消化道、呼吸道和皮肤被人吸收，吸收后主要分布于肝、肾、脂肪和肌肉中。氨基甲酸酯类农药是一种抑制体内胆碱酯酶的神经毒素，具有潜在致癌、致畸、致突变作用[2～4]。近年来，农药残留和食品安全的问题备受关注。
目前，氨基甲酸酯类农药残留的检测方法主要用于蔬菜和水果等样品，环境水体中氨基甲酸酯类农药残留的快速检测鲜有报道。我国现行氨基甲酸酯类农药国家标准检测方法有色谱法[5，6]、胆碱酯酶抑制法[7]等。色谱法定量准确，但仪器体积大，对检测人员的技术要求高；胆碱酯酶抑制法快速、便捷，但灵敏度低，检出限仅为mg/kg级。因此建立灵敏、简便、低成本的环境水体中氨基甲酸酯类农药残留快速检测方法对环境监测领域意义重大。
近年来，非细胞体系生物荧光传感器以快速、灵敏、高通量的优点，在快速检测领域受到广泛关注。非细胞体系是在细胞抽提物的酶系中合成蛋白质的体外系统，具有稳定、快速、高效等特点[8]。Xiong等[9]将绿色荧光蛋白基因同源重组到睾丸酮丛毛单胞菌中甾体激素特异性响应功能基因下游，构建了定量检测甾体激素的非细胞体系生物荧光传感器，灵敏度达到1.0 ng/L。本研究组在质粒pK18的顺式β半乳糖苷酶启动子基因下游，依次插入了甾体激素及多环芳烃的特异性响应功能基因、绿色荧光蛋白基因，并将质粒转入大肠杆菌BL21中，构建了定量检测甾体激素及多环芳烃的非细胞体系高效生物荧光传感器，灵敏度达到0.1 ng/L[10] 。
本研究通过构建氨基甲酸酯类农药降解菌H5基因组文库，筛选出氨基甲酸酯类农药特异性响应功能基因的调控序列，与增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因连接，构建了检测氨基甲酸酯类农药残留的非细胞体系生物荧光传感器，用于环境水体中的农残检测。当样本中含有氨基甲酸酯类农药时EGFP表达并发光，荧光值在一定范围内与农药含量呈正相关。
2实验部分
2.1仪器与试剂
Synergy2荧光酶标仪（美国BioTek公司）； 96孔微孔黑板（美国Corning公司）； LC20A高效液相色谱仪、 UV2550紫外可见光分光光度计（日本岛津公司）； 5810R冷冻高速离心机（德国Eppendorf公司）； HZQF160全温振荡培养箱（哈东联公司）。
H5菌株（本实验室保存）、质粒pKEGFP2（本实验室构建）；大肠杆菌HB101（北京鼎国生物公司）。
呋喃丹标准品（中国药品生物制品检定所）；LB培养基、无机盐培养基、Kanamycin（北京鼎国公司）；限制性内切酶、碱性磷酸酶（NEB公司）；其它试剂均为分析纯，实验用水为去离子水。
呋喃丹标准液配制：呋喃丹标准品0.01 g，加入10 mL丙酮溶解，再用含有10%丙酮的磷酸盐缓冲液（PBS）将其稀释成所需浓度的呋喃丹标准液。
2.2H5菌株对氨基甲酸酯类农药降解功能的鉴定
配制50 mg/L呋喃丹，作为唯一碳源的无机盐培养基，分别加入HB101菌液和H5菌液，HB101菌液在37 ℃，H5菌液在27 ℃，2000 r/min，培养14 h，高效液相（HPLC）法检测培养基中呋喃丹含量。HPLC条件：ODSC18反向柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇水（70∶30， V/V）；流速1 mL/min；柱温30 ℃；紫外检测器，检测波长210 nm。
2.3H5菌株基因组文库的构建及功能基因调控序列的筛选
参照基因组文库构建方法[11]，用限制性内切酶BamHI酶切H5染色体及载体pKEGFP2，将其连接，转化HB101感受态细胞，Kanamycin 抗性LB固体培养基筛选单克隆。将筛选出的单克隆菌液与10， 100和1000 ng/L呋喃丹标准液在96孔微孔黑板中诱导培养1 h，荧光酶标仪检测荧光强度，激发波长475nm，发射波长509 nm，选取荧光强度与呋喃丹浓度正相关且荧光增强率（FE）最大的克隆子。
关键词：氨基甲酸酯类农药； 基因组文库； 生物荧光传感器； 非细胞体系
1引言
氨基甲酸酯类农药是农作物防治虫害的常用农药[1]，常用的如呋喃丹（2，3二氢2，2二甲基7苯并呋喃基甲基氨基甲酸酯）、西维因 （（1萘基）N甲基氨基甲酸酯），它们是主要的氨基甲酸酯类杀虫剂，能被植物的根、茎、叶吸收，并在作物内传导；可经消化道、呼吸道和皮肤被人吸收，吸收后主要分布于肝、肾、脂肪和肌肉中。氨基甲酸酯类农药是一种抑制体内胆碱酯酶的神经毒素，具有潜在致癌、致畸、致突变作用[2～4]。近年来，农药残留和食品安全的问题备受关注。
目前，氨基甲酸酯类农药残留的检测方法主要用于蔬菜和水果等样品，环境水体中氨基甲酸酯类农药残留的快速检测鲜有报道。我国现行氨基甲酸酯类农药国家标准检测方法有色谱法[5，6]、胆碱酯酶抑制法[7]等。色谱法定量准确，但仪器体积大，对检测人员的技术要求高；胆碱酯酶抑制法快速、便捷，但灵敏度低，检出限仅为mg/kg级。因此建立灵敏、简便、低成本的环境水体中氨基甲酸酯类农药残留快速检测方法对环境监测领域意义重大。
近年来，非细胞体系生物荧光传感器以快速、灵敏、高通量的优点，在快速检测领域受到广泛关注。非细胞体系是在细胞抽提物的酶系中合成蛋白质的体外系统，具有稳定、快速、高效等特点[8]。Xiong等[9]将绿色荧光蛋白基因同源重组到睾丸酮丛毛单胞菌中甾体激素特异性响应功能基因下游，构建了定量检测甾体激素的非细胞体系生物荧光传感器，灵敏度达到1.0 ng/L。本研究组在质粒pK18的顺式β半乳糖苷酶启动子基因下游，依次插入了甾体激素及多环芳烃的特异性响应功能基因、绿色荧光蛋白基因，并将质粒转入大肠杆菌BL21中，构建了定量检测甾体激素及多环芳烃的非细胞体系高效生物荧光传感器，灵敏度达到0.1 ng/L[10] 。
本研究通过构建氨基甲酸酯类农药降解菌H5基因组文库，筛选出氨基甲酸酯类农药特异性响应功能基因的调控序列，与增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因连接，构建了检测氨基甲酸酯类农药残留的非细胞体系生物荧光传感器，用于环境水体中的农残检测。当样本中含有氨基甲酸酯类农药时EGFP表达并发光，荧光值在一定范围内与农药含量呈正相关。
2实验部分
2.1仪器与试剂
Synergy2荧光酶标仪（美国BioTek公司）； 96孔微孔黑板（美国Corning公司）； LC20A高效液相色谱仪、 UV2550紫外可见光分光光度计（日本岛津公司）； 5810R冷冻高速离心机（德国Eppendorf公司）； HZQF160全温振荡培养箱（哈东联公司）。
H5菌株（本实验室保存）、质粒pKEGFP2（本实验室构建）；大肠杆菌HB101（北京鼎国生物公司）。
呋喃丹标准品（中国药品生物制品检定所）；LB培养基、无机盐培养基、Kanamycin（北京鼎国公司）；限制性内切酶、碱性磷酸酶（NEB公司）；其它试剂均为分析纯，实验用水为去离子水。
呋喃丹标准液配制：呋喃丹标准品0.01 g，加入10 mL丙酮溶解，再用含有10%丙酮的磷酸盐缓冲液（PBS）将其稀释成所需浓度的呋喃丹标准液。
2.2H5菌株对氨基甲酸酯类农药降解功能的鉴定
配制50 mg/L呋喃丹，作为唯一碳源的无机盐培养基，分别加入HB101菌液和H5菌液，HB101菌液在37 ℃，H5菌液在27 ℃，2000 r/min，培养14 h，高效液相（HPLC）法检测培养基中呋喃丹含量。HPLC条件：ODSC18反向柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇水（70∶30， V/V）；流速1 mL/min；柱温30 ℃；紫外检测器，检测波长210 nm。
2.3H5菌株基因组文库的构建及功能基因调控序列的筛选
参照基因组文库构建方法[11]，用限制性内切酶BamHI酶切H5染色体及载体pKEGFP2，将其连接，转化HB101感受态细胞，Kanamycin 抗性LB固体培养基筛选单克隆。将筛选出的单克隆菌液与10， 100和1000 ng/L呋喃丹标准液在96孔微孔黑板中诱导培养1 h，荧光酶标仪检测荧光强度，激发波长475nm，发射波长509 nm，选取荧光强度与呋喃丹浓度正相关且荧光增强率（FE）最大的克隆子。
关键词：氨基甲酸酯类农药； 基因组文库； 生物荧光传感器； 非细胞体系
1引言
氨基甲酸酯类农药是农作物防治虫害的常用农药[1]，常用的如呋喃丹（2，3二氢2，2二甲基7苯并呋喃基甲基氨基甲酸酯）、西维因 （（1萘基）N甲基氨基甲酸酯），它们是主要的氨基甲酸酯类杀虫剂，能被植物的根、茎、叶吸收，并在作物内传导；可经消化道、呼吸道和皮肤被人吸收，吸收后主要分布于肝、肾、脂肪和肌肉中。氨基甲酸酯类农药是一种抑制体内胆碱酯酶的神经毒素，具有潜在致癌、致畸、致突变作用[2～4]。近年来，农药残留和食品安全的问题备受关注。
目前，氨基甲酸酯类农药残留的检测方法主要用于蔬菜和水果等样品，环境水体中氨基甲酸酯类农药残留的快速检测鲜有报道。我国现行氨基甲酸酯类农药国家标准检测方法有色谱法[5，6]、胆碱酯酶抑制法[7]等。色谱法定量准确，但仪器体积大，对检测人员的技术要求高；胆碱酯酶抑制法快速、便捷，但灵敏度低，检出限仅为mg/kg级。因此建立灵敏、简便、低成本的环境水体中氨基甲酸酯类农药残留快速检测方法对环境监测领域意义重大。
近年来，非细胞体系生物荧光传感器以快速、灵敏、高通量的优点，在快速检测领域受到广泛关注。非细胞体系是在细胞抽提物的酶系中合成蛋白质的体外系统，具有稳定、快速、高效等特点[8]。Xiong等[9]将绿色荧光蛋白基因同源重组到睾丸酮丛毛单胞菌中甾体激素特异性响应功能基因下游，构建了定量检测甾体激素的非细胞体系生物荧光传感器，灵敏度达到1.0 ng/L。本研究组在质粒pK18的顺式β半乳糖苷酶启动子基因下游，依次插入了甾体激素及多环芳烃的特异性响应功能基因、绿色荧光蛋白基因，并将质粒转入大肠杆菌BL21中，构建了定量检测甾体激素及多环芳烃的非细胞体系高效生物荧光传感器，灵敏度达到0.1 ng/L[10] 。
本研究通过构建氨基甲酸酯类农药降解菌H5基因组文库，筛选出氨基甲酸酯类农药特异性响应功能基因的调控序列，与增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因连接，构建了检测氨基甲酸酯类农药残留的非细胞体系生物荧光传感器，用于环境水体中的农残检测。当样本中含有氨基甲酸酯类农药时EGFP表达并发光，荧光值在一定范围内与农药含量呈正相关。
2实验部分
2.1仪器与试剂
Synergy2荧光酶标仪（美国BioTek公司）； 96孔微孔黑板（美国Corning公司）； LC20A高效液相色谱仪、 UV2550紫外可见光分光光度计（日本岛津公司）； 5810R冷冻高速离心机（德国Eppendorf公司）； HZQF160全温振荡培养箱（哈东联公司）。
H5菌株（本实验室保存）、质粒pKEGFP2（本实验室构建）；大肠杆菌HB101（北京鼎国生物公司）。
呋喃丹标准品（中国药品生物制品检定所）；LB培养基、无机盐培养基、Kanamycin（北京鼎国公司）；限制性内切酶、碱性磷酸酶（NEB公司）；其它试剂均为分析纯，实验用水为去离子水。
呋喃丹标准液配制：呋喃丹标准品0.01 g，加入10 mL丙酮溶解，再用含有10%丙酮的磷酸盐缓冲液（PBS）将其稀释成所需浓度的呋喃丹标准液。
2.2H5菌株对氨基甲酸酯类农药降解功能的鉴定
配制50 mg/L呋喃丹，作为唯一碳源的无机盐培养基，分别加入HB101菌液和H5菌液，HB101菌液在37 ℃，H5菌液在27 ℃，2000 r/min，培养14 h，高效液相（HPLC）法检测培养基中呋喃丹含量。HPLC条件：ODSC18反向柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇水（70∶30， V/V）；流速1 mL/min；柱温30 ℃；紫外检测器，检测波长210 nm。
2.3H5菌株基因组文库的构建及功能基因调控序列的筛选
参照基因组文库构建方法[11]，用限制性内切酶BamHI酶切H5染色体及载体pKEGFP2，将其连接，转化HB101感受态细胞，Kanamycin 抗性LB固体培养基筛选单克隆。将筛选出的单克隆菌液与10， 100和1000 ng/L呋喃丹标准液在96孔微孔黑板中诱导培养1 h，荧光酶标仪检测荧光强度，激发波长475nm，发射波长509 nm，选取荧光强度与呋喃丹浓度正相关且荧光增强率（FE）最大的克隆子。
