丹酚酸A甲基结合代谢物的制备与结构鉴定
翟文婷等
摘要：利用具有高儿茶酚氧位甲基转移酶（COMT）活力的大鼠肝细胞液体外温孵代谢反应，首次制备了4种丹酚酸A（SAA）的甲基结合代谢物。HPLC分析结果显示，这些体外温孵代谢产物与大鼠经静脉途径给予SAA后在体内生成的代谢产物一致。以ODS为固定相，甲醇水混合溶剂体系梯度洗脱，经中压柱层析分离，制得纯度在95%以上的代谢产物单体成分。综合应用ESIMS、MS2， 以及1H NMR， 13C NMR， HSQC和HMBC等波谱方法，并与母体化合物SAA进行波谱数据的对比分析，鉴定这4种甲基结合代谢物分别为3甲氧基丹酚酸A（1）、3′甲氧基丹酚酸A（2）、3，3″二甲氧基丹酚酸A（3）和3′，3″二甲氧基丹酚酸A（4）。
关键词：丹酚酸A；体外酶促甲基结合代谢；结构鉴定；质谱；核磁共振谱
1引言
化合物在体内吸收、分布、代谢和排泄的过程（Absorption， distribution， metabolism， excretion， ADME）是其成药性评价的关键指标，并贯穿新药研发至临床应用的全过程。在药物设计及新药开发早期就开展药物代谢研究，不仅有利于提高新药研发的成功率，还是新药发现和药物设计的重要来源，受到国际医药界的普遍关注[1～3]。
丹酚酸A（Salvianolic acid A，SAA）是丹参Salvia miltiorrhiza Bge.中一种微量的水溶性酚酸类成分，由一分子丹参素与两分子咖啡酸缩合而成（图1），是丹参活血化瘀的主要功效成分[4]，具有抗氧化、抗凝、抗血栓形成等多种药理活性，已作为心脑血管保护剂候选药物进入开发阶段[5，6]。与诸多的天然多酚类化合物一样，分布在A、B、C环上的3对邻二酚羟基结构可能导致SAA在体内发生快速且广泛的代谢转化， 这一推测已为包括人源重组酶体外温孵在内的众多实验研究结果证实。研究表明，SAA在体内主要经肝脏的儿茶酚氧位甲基转移酶（CatecholOmethyl transferase， COMT）和尿苷二磷酸葡醛酸转移酶（Uridinediphosphateglucuronosyltransferases， UGTs）代谢，生成包括葡醛酸和/或甲基结合在内的多种Ⅱ相结合代谢产物，成为其发挥体内药效作用的直接物质基础[7～10]。
本研究在前期工作[11]基础上，利用富含COMT酶的大鼠肝细胞液为酶供体的体外温孵代谢反应体系，结合中压柱层析技术，分离制备了4种与体内一致的SAA甲基结合代谢物，并综合应用质谱和核磁共振波谱方法阐明了其化学结构特征（图1）。相关研究结果将为揭示SAA的体内代谢过程以及基于活性代谢产物的新药筛选和发现提供基础。
2实验部分
2.1仪器与试剂
Agilent 1100高效液相色谱仪（美国Agilent公司），包括在线脱气机、二元高压泵、自动进样器；Thermo TSQ Quantum Access三重四级杆串联质谱仪（美国Thermo Fisher Scientific Inc.），包括电喷雾离子化接口和Xcalibur色谱工作站，与Agilent 1100高效液相色谱仪构成HPLCMS联用分析系统；Bruker Avance 400核磁共振波谱仪（德国Bruker公司）。丹酚酸A（纯度98.6%，山东靶点药物研究有限公司）； S腺苷甲硫氨酸（SAM，纯度≥98%，陕西森弗生物技术有限公司）； 乙腈、甲酸水（HPLC级，FLUKA公司）； ODS（YMCAA12S50，50 μm，日本）。其它溶剂和试剂均为国产分析纯，实验用水为超纯水。
2.2.3甲基结合代谢物的体外酶促温孵制备与分离钙沉淀法分离制备大鼠肝细胞液，Bradford法测定蛋白含量。孵育体系以磷酸盐缓冲液（0.1 mol/L，pH 7.4）为基质，其中含2 mmol/L MgCl2、适量甲基供体（SAM辅因子）和大鼠肝细胞液（加入体积依其中蛋白含量确定）。于37℃恒温水浴中振荡预孵育5 min，加入SAA溶液，继续孵育15 min后加5 mol/L HCl终止反应。于终止反应液中加入5倍体积乙酸乙酯超声提取，离心（8000 r/min×10 min），取上清液于40℃水浴下氮气流吹干，残渣复溶，以ODS为固定相，进行中压柱层析分离（20 cm× 1.5 cm），以甲醇水混合溶剂系统梯度洗脱，HPLC跟踪监测，收集、合并保留时间相同的馏分，减压回收溶剂后真空干燥，得化合物1， 2， 3和4。经HPLC检测，各化合物的色谱归一化纯度均在95%以上，适于进行结构分析。
3结果与讨论
3.1代谢物的体内外一致性分析
在相同色谱条件下，分别测定了空白大鼠肝细胞液孵育体系（不含SAA）、SAA与大鼠肝细胞液体外共孵育体系、空白大鼠胆汁以及大鼠尾静脉注射给予SAA后0～2 h内收集的胆汁样品的HPLC图谱，结果如图2所示。其中，在SAA与大鼠肝细胞液体外共孵育体系中（图2Ab），可见除内源性物质及少量未反应完全的SAA外有4个主要色谱峰（根据色谱出峰先后依次标记为1， 2， 3和4），其色谱保留时间均大于SAA，表明在优化的体外孵育条件下SAA被快速、完全地代谢，生成4个极性明显低于SAA的主要代谢产物。进一步考察相同色谱条件下给药大鼠胆汁样品的HPLC图谱，发现除胆汁内源性物质和SAA外尚含有多个代谢产物，其中14 min后的色谱图轮廓与图2Bb相似，亦给出4个主要色谱峰，且色谱保留时间完全一致，仅在色谱峰的相对高度上有所差异。上述结果表明，建立的以大鼠肝细胞液为酶供体的体外酶促温孵体系可以快速生成与体内一致的SAA代谢物，可作为反应体系进行体内代谢物的富集制备。
摘要：利用具有高儿茶酚氧位甲基转移酶（COMT）活力的大鼠肝细胞液体外温孵代谢反应，首次制备了4种丹酚酸A（SAA）的甲基结合代谢物。HPLC分析结果显示，这些体外温孵代谢产物与大鼠经静脉途径给予SAA后在体内生成的代谢产物一致。以ODS为固定相，甲醇水混合溶剂体系梯度洗脱，经中压柱层析分离，制得纯度在95%以上的代谢产物单体成分。综合应用ESIMS、MS2， 以及1H NMR， 13C NMR， HSQC和HMBC等波谱方法，并与母体化合物SAA进行波谱数据的对比分析，鉴定这4种甲基结合代谢物分别为3甲氧基丹酚酸A（1）、3′甲氧基丹酚酸A（2）、3，3″二甲氧基丹酚酸A（3）和3′，3″二甲氧基丹酚酸A（4）。
关键词：丹酚酸A；体外酶促甲基结合代谢；结构鉴定；质谱；核磁共振谱
1引言
化合物在体内吸收、分布、代谢和排泄的过程（Absorption， distribution， metabolism， excretion， ADME）是其成药性评价的关键指标，并贯穿新药研发至临床应用的全过程。在药物设计及新药开发早期就开展药物代谢研究，不仅有利于提高新药研发的成功率，还是新药发现和药物设计的重要来源，受到国际医药界的普遍关注[1～3]。
丹酚酸A（Salvianolic acid A，SAA）是丹参Salvia miltiorrhiza Bge.中一种微量的水溶性酚酸类成分，由一分子丹参素与两分子咖啡酸缩合而成（图1），是丹参活血化瘀的主要功效成分[4]，具有抗氧化、抗凝、抗血栓形成等多种药理活性，已作为心脑血管保护剂候选药物进入开发阶段[5，6]。与诸多的天然多酚类化合物一样，分布在A、B、C环上的3对邻二酚羟基结构可能导致SAA在体内发生快速且广泛的代谢转化， 这一推测已为包括人源重组酶体外温孵在内的众多实验研究结果证实。研究表明，SAA在体内主要经肝脏的儿茶酚氧位甲基转移酶（CatecholOmethyl transferase， COMT）和尿苷二磷酸葡醛酸转移酶（Uridinediphosphateglucuronosyltransferases， UGTs）代谢，生成包括葡醛酸和/或甲基结合在内的多种Ⅱ相结合代谢产物，成为其发挥体内药效作用的直接物质基础[7～10]。
本研究在前期工作[11]基础上，利用富含COMT酶的大鼠肝细胞液为酶供体的体外温孵代谢反应体系，结合中压柱层析技术，分离制备了4种与体内一致的SAA甲基结合代谢物，并综合应用质谱和核磁共振波谱方法阐明了其化学结构特征（图1）。相关研究结果将为揭示SAA的体内代谢过程以及基于活性代谢产物的新药筛选和发现提供基础。
2实验部分
2.1仪器与试剂
Agilent 1100高效液相色谱仪（美国Agilent公司），包括在线脱气机、二元高压泵、自动进样器；Thermo TSQ Quantum Access三重四级杆串联质谱仪（美国Thermo Fisher Scientific Inc.），包括电喷雾离子化接口和Xcalibur色谱工作站，与Agilent 1100高效液相色谱仪构成HPLCMS联用分析系统；Bruker Avance 400核磁共振波谱仪（德国Bruker公司）。丹酚酸A（纯度98.6%，山东靶点药物研究有限公司）； S腺苷甲硫氨酸（SAM，纯度≥98%，陕西森弗生物技术有限公司）； 乙腈、甲酸水（HPLC级，FLUKA公司）； ODS（YMCAA12S50，50 μm，日本）。其它溶剂和试剂均为国产分析纯，实验用水为超纯水。
2.2.3甲基结合代谢物的体外酶促温孵制备与分离钙沉淀法分离制备大鼠肝细胞液，Bradford法测定蛋白含量。孵育体系以磷酸盐缓冲液（0.1 mol/L，pH 7.4）为基质，其中含2 mmol/L MgCl2、适量甲基供体（SAM辅因子）和大鼠肝细胞液（加入体积依其中蛋白含量确定）。于37℃恒温水浴中振荡预孵育5 min，加入SAA溶液，继续孵育15 min后加5 mol/L HCl终止反应。于终止反应液中加入5倍体积乙酸乙酯超声提取，离心（8000 r/min×10 min），取上清液于40℃水浴下氮气流吹干，残渣复溶，以ODS为固定相，进行中压柱层析分离（20 cm× 1.5 cm），以甲醇水混合溶剂系统梯度洗脱，HPLC跟踪监测，收集、合并保留时间相同的馏分，减压回收溶剂后真空干燥，得化合物1， 2， 3和4。经HPLC检测，各化合物的色谱归一化纯度均在95%以上，适于进行结构分析。
3结果与讨论
3.1代谢物的体内外一致性分析
在相同色谱条件下，分别测定了空白大鼠肝细胞液孵育体系（不含SAA）、SAA与大鼠肝细胞液体外共孵育体系、空白大鼠胆汁以及大鼠尾静脉注射给予SAA后0～2 h内收集的胆汁样品的HPLC图谱，结果如图2所示。其中，在SAA与大鼠肝细胞液体外共孵育体系中（图2Ab），可见除内源性物质及少量未反应完全的SAA外有4个主要色谱峰（根据色谱出峰先后依次标记为1， 2， 3和4），其色谱保留时间均大于SAA，表明在优化的体外孵育条件下SAA被快速、完全地代谢，生成4个极性明显低于SAA的主要代谢产物。进一步考察相同色谱条件下给药大鼠胆汁样品的HPLC图谱，发现除胆汁内源性物质和SAA外尚含有多个代谢产物，其中14 min后的色谱图轮廓与图2Bb相似，亦给出4个主要色谱峰，且色谱保留时间完全一致，仅在色谱峰的相对高度上有所差异。上述结果表明，建立的以大鼠肝细胞液为酶供体的体外酶促温孵体系可以快速生成与体内一致的SAA代谢物，可作为反应体系进行体内代谢物的富集制备。
摘要：利用具有高儿茶酚氧位甲基转移酶（COMT）活力的大鼠肝细胞液体外温孵代谢反应，首次制备了4种丹酚酸A（SAA）的甲基结合代谢物。HPLC分析结果显示，这些体外温孵代谢产物与大鼠经静脉途径给予SAA后在体内生成的代谢产物一致。以ODS为固定相，甲醇水混合溶剂体系梯度洗脱，经中压柱层析分离，制得纯度在95%以上的代谢产物单体成分。综合应用ESIMS、MS2， 以及1H NMR， 13C NMR， HSQC和HMBC等波谱方法，并与母体化合物SAA进行波谱数据的对比分析，鉴定这4种甲基结合代谢物分别为3甲氧基丹酚酸A（1）、3′甲氧基丹酚酸A（2）、3，3″二甲氧基丹酚酸A（3）和3′，3″二甲氧基丹酚酸A（4）。
关键词：丹酚酸A；体外酶促甲基结合代谢；结构鉴定；质谱；核磁共振谱
1引言
化合物在体内吸收、分布、代谢和排泄的过程（Absorption， distribution， metabolism， excretion， ADME）是其成药性评价的关键指标，并贯穿新药研发至临床应用的全过程。在药物设计及新药开发早期就开展药物代谢研究，不仅有利于提高新药研发的成功率，还是新药发现和药物设计的重要来源，受到国际医药界的普遍关注[1～3]。
丹酚酸A（Salvianolic acid A，SAA）是丹参Salvia miltiorrhiza Bge.中一种微量的水溶性酚酸类成分，由一分子丹参素与两分子咖啡酸缩合而成（图1），是丹参活血化瘀的主要功效成分[4]，具有抗氧化、抗凝、抗血栓形成等多种药理活性，已作为心脑血管保护剂候选药物进入开发阶段[5，6]。与诸多的天然多酚类化合物一样，分布在A、B、C环上的3对邻二酚羟基结构可能导致SAA在体内发生快速且广泛的代谢转化， 这一推测已为包括人源重组酶体外温孵在内的众多实验研究结果证实。研究表明，SAA在体内主要经肝脏的儿茶酚氧位甲基转移酶（CatecholOmethyl transferase， COMT）和尿苷二磷酸葡醛酸转移酶（Uridinediphosphateglucuronosyltransferases， UGTs）代谢，生成包括葡醛酸和/或甲基结合在内的多种Ⅱ相结合代谢产物，成为其发挥体内药效作用的直接物质基础[7～10]。
本研究在前期工作[11]基础上，利用富含COMT酶的大鼠肝细胞液为酶供体的体外温孵代谢反应体系，结合中压柱层析技术，分离制备了4种与体内一致的SAA甲基结合代谢物，并综合应用质谱和核磁共振波谱方法阐明了其化学结构特征（图1）。相关研究结果将为揭示SAA的体内代谢过程以及基于活性代谢产物的新药筛选和发现提供基础。
2实验部分
2.1仪器与试剂
Agilent 1100高效液相色谱仪（美国Agilent公司），包括在线脱气机、二元高压泵、自动进样器；Thermo TSQ Quantum Access三重四级杆串联质谱仪（美国Thermo Fisher Scientific Inc.），包括电喷雾离子化接口和Xcalibur色谱工作站，与Agilent 1100高效液相色谱仪构成HPLCMS联用分析系统；Bruker Avance 400核磁共振波谱仪（德国Bruker公司）。丹酚酸A（纯度98.6%，山东靶点药物研究有限公司）； S腺苷甲硫氨酸（SAM，纯度≥98%，陕西森弗生物技术有限公司）； 乙腈、甲酸水（HPLC级，FLUKA公司）； ODS（YMCAA12S50，50 μm，日本）。其它溶剂和试剂均为国产分析纯，实验用水为超纯水。
2.2.3甲基结合代谢物的体外酶促温孵制备与分离钙沉淀法分离制备大鼠肝细胞液，Bradford法测定蛋白含量。孵育体系以磷酸盐缓冲液（0.1 mol/L，pH 7.4）为基质，其中含2 mmol/L MgCl2、适量甲基供体（SAM辅因子）和大鼠肝细胞液（加入体积依其中蛋白含量确定）。于37℃恒温水浴中振荡预孵育5 min，加入SAA溶液，继续孵育15 min后加5 mol/L HCl终止反应。于终止反应液中加入5倍体积乙酸乙酯超声提取，离心（8000 r/min×10 min），取上清液于40℃水浴下氮气流吹干，残渣复溶，以ODS为固定相，进行中压柱层析分离（20 cm× 1.5 cm），以甲醇水混合溶剂系统梯度洗脱，HPLC跟踪监测，收集、合并保留时间相同的馏分，减压回收溶剂后真空干燥，得化合物1， 2， 3和4。经HPLC检测，各化合物的色谱归一化纯度均在95%以上，适于进行结构分析。
3结果与讨论
3.1代谢物的体内外一致性分析
在相同色谱条件下，分别测定了空白大鼠肝细胞液孵育体系（不含SAA）、SAA与大鼠肝细胞液体外共孵育体系、空白大鼠胆汁以及大鼠尾静脉注射给予SAA后0～2 h内收集的胆汁样品的HPLC图谱，结果如图2所示。其中，在SAA与大鼠肝细胞液体外共孵育体系中（图2Ab），可见除内源性物质及少量未反应完全的SAA外有4个主要色谱峰（根据色谱出峰先后依次标记为1， 2， 3和4），其色谱保留时间均大于SAA，表明在优化的体外孵育条件下SAA被快速、完全地代谢，生成4个极性明显低于SAA的主要代谢产物。进一步考察相同色谱条件下给药大鼠胆汁样品的HPLC图谱，发现除胆汁内源性物质和SAA外尚含有多个代谢产物，其中14 min后的色谱图轮廓与图2Bb相似，亦给出4个主要色谱峰，且色谱保留时间完全一致，仅在色谱峰的相对高度上有所差异。上述结果表明，建立的以大鼠肝细胞液为酶供体的体外酶促温孵体系可以快速生成与体内一致的SAA代谢物，可作为反应体系进行体内代谢物的富集制备。
摘要：利用具有高儿茶酚氧位甲基转移酶（COMT）活力的大鼠肝细胞液体外温孵代谢反应，首次制备了4种丹酚酸A（SAA）的甲基结合代谢物。HPLC分析结果显示，这些体外温孵代谢产物与大鼠经静脉途径给予SAA后在体内生成的代谢产物一致。以ODS为固定相，甲醇水混合溶剂体系梯度洗脱，经中压柱层析分离，制得纯度在95%以上的代谢产物单体成分。综合应用ESIMS、MS2， 以及1H NMR， 13C NMR， HSQC和HMBC等波谱方法，并与母体化合物SAA进行波谱数据的对比分析，鉴定这4种甲基结合代谢物分别为3甲氧基丹酚酸A（1）、3′甲氧基丹酚酸A（2）、3，3″二甲氧基丹酚酸A（3）和3′，3″二甲氧基丹酚酸A（4）。
关键词：丹酚酸A；体外酶促甲基结合代谢；结构鉴定；质谱；核磁共振谱
1引言
化合物在体内吸收、分布、代谢和排泄的过程（Absorption， distribution， metabolism， excretion， ADME）是其成药性评价的关键指标，并贯穿新药研发至临床应用的全过程。在药物设计及新药开发早期就开展药物代谢研究，不仅有利于提高新药研发的成功率，还是新药发现和药物设计的重要来源，受到国际医药界的普遍关注[1～3]。
丹酚酸A（Salvianolic acid A，SAA）是丹参Salvia miltiorrhiza Bge.中一种微量的水溶性酚酸类成分，由一分子丹参素与两分子咖啡酸缩合而成（图1），是丹参活血化瘀的主要功效成分[4]，具有抗氧化、抗凝、抗血栓形成等多种药理活性，已作为心脑血管保护剂候选药物进入开发阶段[5，6]。与诸多的天然多酚类化合物一样，分布在A、B、C环上的3对邻二酚羟基结构可能导致SAA在体内发生快速且广泛的代谢转化， 这一推测已为包括人源重组酶体外温孵在内的众多实验研究结果证实。研究表明，SAA在体内主要经肝脏的儿茶酚氧位甲基转移酶（CatecholOmethyl transferase， COMT）和尿苷二磷酸葡醛酸转移酶（Uridinediphosphateglucuronosyltransferases， UGTs）代谢，生成包括葡醛酸和/或甲基结合在内的多种Ⅱ相结合代谢产物，成为其发挥体内药效作用的直接物质基础[7～10]。
本研究在前期工作[11]基础上，利用富含COMT酶的大鼠肝细胞液为酶供体的体外温孵代谢反应体系，结合中压柱层析技术，分离制备了4种与体内一致的SAA甲基结合代谢物，并综合应用质谱和核磁共振波谱方法阐明了其化学结构特征（图1）。相关研究结果将为揭示SAA的体内代谢过程以及基于活性代谢产物的新药筛选和发现提供基础。
2实验部分
2.1仪器与试剂
Agilent 1100高效液相色谱仪（美国Agilent公司），包括在线脱气机、二元高压泵、自动进样器；Thermo TSQ Quantum Access三重四级杆串联质谱仪（美国Thermo Fisher Scientific Inc.），包括电喷雾离子化接口和Xcalibur色谱工作站，与Agilent 1100高效液相色谱仪构成HPLCMS联用分析系统；Bruker Avance 400核磁共振波谱仪（德国Bruker公司）。丹酚酸A（纯度98.6%，山东靶点药物研究有限公司）； S腺苷甲硫氨酸（SAM，纯度≥98%，陕西森弗生物技术有限公司）； 乙腈、甲酸水（HPLC级，FLUKA公司）； ODS（YMCAA12S50，50 μm，日本）。其它溶剂和试剂均为国产分析纯，实验用水为超纯水。
2.2.3甲基结合代谢物的体外酶促温孵制备与分离钙沉淀法分离制备大鼠肝细胞液，Bradford法测定蛋白含量。孵育体系以磷酸盐缓冲液（0.1 mol/L，pH 7.4）为基质，其中含2 mmol/L MgCl2、适量甲基供体（SAM辅因子）和大鼠肝细胞液（加入体积依其中蛋白含量确定）。于37℃恒温水浴中振荡预孵育5 min，加入SAA溶液，继续孵育15 min后加5 mol/L HCl终止反应。于终止反应液中加入5倍体积乙酸乙酯超声提取，离心（8000 r/min×10 min），取上清液于40℃水浴下氮气流吹干，残渣复溶，以ODS为固定相，进行中压柱层析分离（20 cm× 1.5 cm），以甲醇水混合溶剂系统梯度洗脱，HPLC跟踪监测，收集、合并保留时间相同的馏分，减压回收溶剂后真空干燥，得化合物1， 2， 3和4。经HPLC检测，各化合物的色谱归一化纯度均在95%以上，适于进行结构分析。
3结果与讨论
3.1代谢物的体内外一致性分析
在相同色谱条件下，分别测定了空白大鼠肝细胞液孵育体系（不含SAA）、SAA与大鼠肝细胞液体外共孵育体系、空白大鼠胆汁以及大鼠尾静脉注射给予SAA后0～2 h内收集的胆汁样品的HPLC图谱，结果如图2所示。其中，在SAA与大鼠肝细胞液体外共孵育体系中（图2Ab），可见除内源性物质及少量未反应完全的SAA外有4个主要色谱峰（根据色谱出峰先后依次标记为1， 2， 3和4），其色谱保留时间均大于SAA，表明在优化的体外孵育条件下SAA被快速、完全地代谢，生成4个极性明显低于SAA的主要代谢产物。进一步考察相同色谱条件下给药大鼠胆汁样品的HPLC图谱，发现除胆汁内源性物质和SAA外尚含有多个代谢产物，其中14 min后的色谱图轮廓与图2Bb相似，亦给出4个主要色谱峰，且色谱保留时间完全一致，仅在色谱峰的相对高度上有所差异。上述结果表明，建立的以大鼠肝细胞液为酶供体的体外酶促温孵体系可以快速生成与体内一致的SAA代谢物，可作为反应体系进行体内代谢物的富集制备。
摘要：利用具有高儿茶酚氧位甲基转移酶（COMT）活力的大鼠肝细胞液体外温孵代谢反应，首次制备了4种丹酚酸A（SAA）的甲基结合代谢物。HPLC分析结果显示，这些体外温孵代谢产物与大鼠经静脉途径给予SAA后在体内生成的代谢产物一致。以ODS为固定相，甲醇水混合溶剂体系梯度洗脱，经中压柱层析分离，制得纯度在95%以上的代谢产物单体成分。综合应用ESIMS、MS2， 以及1H NMR， 13C NMR， HSQC和HMBC等波谱方法，并与母体化合物SAA进行波谱数据的对比分析，鉴定这4种甲基结合代谢物分别为3甲氧基丹酚酸A（1）、3′甲氧基丹酚酸A（2）、3，3″二甲氧基丹酚酸A（3）和3′，3″二甲氧基丹酚酸A（4）。
关键词：丹酚酸A；体外酶促甲基结合代谢；结构鉴定；质谱；核磁共振谱
1引言
化合物在体内吸收、分布、代谢和排泄的过程（Absorption， distribution， metabolism， excretion， ADME）是其成药性评价的关键指标，并贯穿新药研发至临床应用的全过程。在药物设计及新药开发早期就开展药物代谢研究，不仅有利于提高新药研发的成功率，还是新药发现和药物设计的重要来源，受到国际医药界的普遍关注[1～3]。
丹酚酸A（Salvianolic acid A，SAA）是丹参Salvia miltiorrhiza Bge.中一种微量的水溶性酚酸类成分，由一分子丹参素与两分子咖啡酸缩合而成（图1），是丹参活血化瘀的主要功效成分[4]，具有抗氧化、抗凝、抗血栓形成等多种药理活性，已作为心脑血管保护剂候选药物进入开发阶段[5，6]。与诸多的天然多酚类化合物一样，分布在A、B、C环上的3对邻二酚羟基结构可能导致SAA在体内发生快速且广泛的代谢转化， 这一推测已为包括人源重组酶体外温孵在内的众多实验研究结果证实。研究表明，SAA在体内主要经肝脏的儿茶酚氧位甲基转移酶（CatecholOmethyl transferase， COMT）和尿苷二磷酸葡醛酸转移酶（Uridinediphosphateglucuronosyltransferases， UGTs）代谢，生成包括葡醛酸和/或甲基结合在内的多种Ⅱ相结合代谢产物，成为其发挥体内药效作用的直接物质基础[7～10]。
本研究在前期工作[11]基础上，利用富含COMT酶的大鼠肝细胞液为酶供体的体外温孵代谢反应体系，结合中压柱层析技术，分离制备了4种与体内一致的SAA甲基结合代谢物，并综合应用质谱和核磁共振波谱方法阐明了其化学结构特征（图1）。相关研究结果将为揭示SAA的体内代谢过程以及基于活性代谢产物的新药筛选和发现提供基础。
2实验部分
2.1仪器与试剂
Agilent 1100高效液相色谱仪（美国Agilent公司），包括在线脱气机、二元高压泵、自动进样器；Thermo TSQ Quantum Access三重四级杆串联质谱仪（美国Thermo Fisher Scientific Inc.），包括电喷雾离子化接口和Xcalibur色谱工作站，与Agilent 1100高效液相色谱仪构成HPLCMS联用分析系统；Bruker Avance 400核磁共振波谱仪（德国Bruker公司）。丹酚酸A（纯度98.6%，山东靶点药物研究有限公司）； S腺苷甲硫氨酸（SAM，纯度≥98%，陕西森弗生物技术有限公司）； 乙腈、甲酸水（HPLC级，FLUKA公司）； ODS（YMCAA12S50，50 μm，日本）。其它溶剂和试剂均为国产分析纯，实验用水为超纯水。
2.2.3甲基结合代谢物的体外酶促温孵制备与分离钙沉淀法分离制备大鼠肝细胞液，Bradford法测定蛋白含量。孵育体系以磷酸盐缓冲液（0.1 mol/L，pH 7.4）为基质，其中含2 mmol/L MgCl2、适量甲基供体（SAM辅因子）和大鼠肝细胞液（加入体积依其中蛋白含量确定）。于37℃恒温水浴中振荡预孵育5 min，加入SAA溶液，继续孵育15 min后加5 mol/L HCl终止反应。于终止反应液中加入5倍体积乙酸乙酯超声提取，离心（8000 r/min×10 min），取上清液于40℃水浴下氮气流吹干，残渣复溶，以ODS为固定相，进行中压柱层析分离（20 cm× 1.5 cm），以甲醇水混合溶剂系统梯度洗脱，HPLC跟踪监测，收集、合并保留时间相同的馏分，减压回收溶剂后真空干燥，得化合物1， 2， 3和4。经HPLC检测，各化合物的色谱归一化纯度均在95%以上，适于进行结构分析。
3结果与讨论
3.1代谢物的体内外一致性分析
在相同色谱条件下，分别测定了空白大鼠肝细胞液孵育体系（不含SAA）、SAA与大鼠肝细胞液体外共孵育体系、空白大鼠胆汁以及大鼠尾静脉注射给予SAA后0～2 h内收集的胆汁样品的HPLC图谱，结果如图2所示。其中，在SAA与大鼠肝细胞液体外共孵育体系中（图2Ab），可见除内源性物质及少量未反应完全的SAA外有4个主要色谱峰（根据色谱出峰先后依次标记为1， 2， 3和4），其色谱保留时间均大于SAA，表明在优化的体外孵育条件下SAA被快速、完全地代谢，生成4个极性明显低于SAA的主要代谢产物。进一步考察相同色谱条件下给药大鼠胆汁样品的HPLC图谱，发现除胆汁内源性物质和SAA外尚含有多个代谢产物，其中14 min后的色谱图轮廓与图2Bb相似，亦给出4个主要色谱峰，且色谱保留时间完全一致，仅在色谱峰的相对高度上有所差异。上述结果表明，建立的以大鼠肝细胞液为酶供体的体外酶促温孵体系可以快速生成与体内一致的SAA代谢物，可作为反应体系进行体内代谢物的富集制备。
摘要：利用具有高儿茶酚氧位甲基转移酶（COMT）活力的大鼠肝细胞液体外温孵代谢反应，首次制备了4种丹酚酸A（SAA）的甲基结合代谢物。HPLC分析结果显示，这些体外温孵代谢产物与大鼠经静脉途径给予SAA后在体内生成的代谢产物一致。以ODS为固定相，甲醇水混合溶剂体系梯度洗脱，经中压柱层析分离，制得纯度在95%以上的代谢产物单体成分。综合应用ESIMS、MS2， 以及1H NMR， 13C NMR， HSQC和HMBC等波谱方法，并与母体化合物SAA进行波谱数据的对比分析，鉴定这4种甲基结合代谢物分别为3甲氧基丹酚酸A（1）、3′甲氧基丹酚酸A（2）、3，3″二甲氧基丹酚酸A（3）和3′，3″二甲氧基丹酚酸A（4）。
关键词：丹酚酸A；体外酶促甲基结合代谢；结构鉴定；质谱；核磁共振谱
1引言
化合物在体内吸收、分布、代谢和排泄的过程（Absorption， distribution， metabolism， excretion， ADME）是其成药性评价的关键指标，并贯穿新药研发至临床应用的全过程。在药物设计及新药开发早期就开展药物代谢研究，不仅有利于提高新药研发的成功率，还是新药发现和药物设计的重要来源，受到国际医药界的普遍关注[1～3]。
丹酚酸A（Salvianolic acid A，SAA）是丹参Salvia miltiorrhiza Bge.中一种微量的水溶性酚酸类成分，由一分子丹参素与两分子咖啡酸缩合而成（图1），是丹参活血化瘀的主要功效成分[4]，具有抗氧化、抗凝、抗血栓形成等多种药理活性，已作为心脑血管保护剂候选药物进入开发阶段[5，6]。与诸多的天然多酚类化合物一样，分布在A、B、C环上的3对邻二酚羟基结构可能导致SAA在体内发生快速且广泛的代谢转化， 这一推测已为包括人源重组酶体外温孵在内的众多实验研究结果证实。研究表明，SAA在体内主要经肝脏的儿茶酚氧位甲基转移酶（CatecholOmethyl transferase， COMT）和尿苷二磷酸葡醛酸转移酶（Uridinediphosphateglucuronosyltransferases， UGTs）代谢，生成包括葡醛酸和/或甲基结合在内的多种Ⅱ相结合代谢产物，成为其发挥体内药效作用的直接物质基础[7～10]。
本研究在前期工作[11]基础上，利用富含COMT酶的大鼠肝细胞液为酶供体的体外温孵代谢反应体系，结合中压柱层析技术，分离制备了4种与体内一致的SAA甲基结合代谢物，并综合应用质谱和核磁共振波谱方法阐明了其化学结构特征（图1）。相关研究结果将为揭示SAA的体内代谢过程以及基于活性代谢产物的新药筛选和发现提供基础。
2实验部分
2.1仪器与试剂
Agilent 1100高效液相色谱仪（美国Agilent公司），包括在线脱气机、二元高压泵、自动进样器；Thermo TSQ Quantum Access三重四级杆串联质谱仪（美国Thermo Fisher Scientific Inc.），包括电喷雾离子化接口和Xcalibur色谱工作站，与Agilent 1100高效液相色谱仪构成HPLCMS联用分析系统；Bruker Avance 400核磁共振波谱仪（德国Bruker公司）。丹酚酸A（纯度98.6%，山东靶点药物研究有限公司）； S腺苷甲硫氨酸（SAM，纯度≥98%，陕西森弗生物技术有限公司）； 乙腈、甲酸水（HPLC级，FLUKA公司）； ODS（YMCAA12S50，50 μm，日本）。其它溶剂和试剂均为国产分析纯，实验用水为超纯水。
2.2.3甲基结合代谢物的体外酶促温孵制备与分离钙沉淀法分离制备大鼠肝细胞液，Bradford法测定蛋白含量。孵育体系以磷酸盐缓冲液（0.1 mol/L，pH 7.4）为基质，其中含2 mmol/L MgCl2、适量甲基供体（SAM辅因子）和大鼠肝细胞液（加入体积依其中蛋白含量确定）。于37℃恒温水浴中振荡预孵育5 min，加入SAA溶液，继续孵育15 min后加5 mol/L HCl终止反应。于终止反应液中加入5倍体积乙酸乙酯超声提取，离心（8000 r/min×10 min），取上清液于40℃水浴下氮气流吹干，残渣复溶，以ODS为固定相，进行中压柱层析分离（20 cm× 1.5 cm），以甲醇水混合溶剂系统梯度洗脱，HPLC跟踪监测，收集、合并保留时间相同的馏分，减压回收溶剂后真空干燥，得化合物1， 2， 3和4。经HPLC检测，各化合物的色谱归一化纯度均在95%以上，适于进行结构分析。
3结果与讨论
3.1代谢物的体内外一致性分析
在相同色谱条件下，分别测定了空白大鼠肝细胞液孵育体系（不含SAA）、SAA与大鼠肝细胞液体外共孵育体系、空白大鼠胆汁以及大鼠尾静脉注射给予SAA后0～2 h内收集的胆汁样品的HPLC图谱，结果如图2所示。其中，在SAA与大鼠肝细胞液体外共孵育体系中（图2Ab），可见除内源性物质及少量未反应完全的SAA外有4个主要色谱峰（根据色谱出峰先后依次标记为1， 2， 3和4），其色谱保留时间均大于SAA，表明在优化的体外孵育条件下SAA被快速、完全地代谢，生成4个极性明显低于SAA的主要代谢产物。进一步考察相同色谱条件下给药大鼠胆汁样品的HPLC图谱，发现除胆汁内源性物质和SAA外尚含有多个代谢产物，其中14 min后的色谱图轮廓与图2Bb相似，亦给出4个主要色谱峰，且色谱保留时间完全一致，仅在色谱峰的相对高度上有所差异。上述结果表明，建立的以大鼠肝细胞液为酶供体的体外酶促温孵体系可以快速生成与体内一致的SAA代谢物，可作为反应体系进行体内代谢物的富集制备。
