中药祛斑合剂对衰老模型小鼠皮肤相关指标的影响
赵文斌+欧阳晓勇+郑喜
摘要：目的观察中药祛斑合剂对D-半乳糖所致衰老模型小鼠皮肤相关指标的影响。方法健康昆明种小鼠60只，随机分为正常对照组、衰老模型组、祛斑合剂高、中、低剂量（12.0.6.0，3.0 mL/kg）组和维生素E组（阳性对照组），每组10只。衰老模型组、制剂高、中、低剂量组和维生素E组，颈背部皮下注射5%D-半乳糖连续6w，建立小鼠亚急性衰老模型。给药组同时灌胃给予祛斑合剂和维生素E，正常对照组和衰老模型组给予等体积纯净水。检测皮肤组织匀浆中超氧化物歧化酶（SOD）活力和丙二醛（MDA）、脂褐质（Lpf）、羟脯氨酸（Hyp）含量及皮肤水分含量。结果祛斑合剂可提高皮肤SOD活力，提高Hyp含量及皮肤水分含量；降低皮肤MDA及Lpf含量。结论祛斑合剂具有抗D-半乳糖所致小鼠皮肤衰老的作用。
关键词：中药祛斑合剂；抗皮肤衰老；抗氧化；动物实验
中图分类号：R85.5文献标志码：B文章编号：1007-2349（2018）01-0075-02
皮肤是人体最大的器官，是美容的主要对象。皮肤老化常表现为皮肤干燥、粗糙、脱屑、色斑、松弛、皱纹、皮肤萎缩、血管突显、敏感性和脆性增加等[1]。它不仅影响美观，还与脂溢性角化、基底细胞癌等多种皮肤病有着病因学的联系。因此预防和延缓皮肤衰老一直是近些年医学科学研究的热点之一。本院皮肤科已故专家（国家级名老中医学术经验继承指导老师、云南省名老中医）刘复兴教授经验方中药祛斑合剂（院内制剂），多年来临床应用于防治黄褐斑、皮肤老化，取得较好疗效。笔者采用中药祛斑合剂对抗小鼠皮肤衰老做了实验研究，现将结果报道如下。
1材料与方法
1.1实验动物及材料清洁级健康昆明种小鼠，体重18-22 g，雌雄各半，购自昆明医科大学实验动物中心，中药祛斑合剂由云南省中医医院制剂中心提供；超氧化物歧化酶（SOD）试剂盒、脂褐质Lpf试剂盒、丙二醛（MDA）试剂盒、羟脯氨酸（Hyp）试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司）；D-半乳糖（上海藍季科技发展有限公司）；维生素E（浙江医药有限公司）；其余试剂为市售分析纯。 751光栅分光光度计，RF.540荧光分光光度计，MEGAFUGE 1.0R高速台式离心机。
1.2实验方法[2-3]
1.2.1动物模型制备、分组、给药及取材选择清洁级健康昆明种小鼠60只，体重（20±2）g，雌雄不限，随机分成6组，每组10只，雌雄分笼饲养，饲养温度为18～22℃，相对湿度为45%～55%，规律光照，自由饮食，适应性饲养1 W后开始实验。随机分为正常对照组、衰老模型组、中药祛斑合剂高、中、低剂量组和维生素E组（阳性对照组），每组10只，分笼饲养。衰老模型组、制剂高、中、低剂量组和维生素E组，每日经颈背部皮下注射5%D-半乳糖25 mL/kg，建立小鼠亚急性衰老模型[4]，正常对照组每日经颈背部皮下注射等体积的生理盐水。同时祛斑合剂各组每日灌胃给予祛斑合剂（高12.0、中6.0、低3.0 mL/kg）；维生素E组每日灌胃给予维生素E 500 mg/kg；正常对照组和衰老模型组每日灌胃给予等体积纯净水，各组均连续给药6 W。第7周处死动物前1 d，所有动物两肩胛至两髂骨之间背部皮肤以10%Na2S溶液对称脱毛（面积为3 cm×3 cm）；第2天处死动物，取背部正中皮肤0.5 cm×0.5 cm大小，留取1 g待测含水量用，其余迅速冰冻保存，拟作皮肤组织匀浆及测定皮肤羟脯氨酸等指标之用，各指标所选取材部位相同。实验过程中，每5 d各鼠称重记录1次，每日观察小鼠的皮毛色泽、饮食、饮水、大小便、精神活动情况等。
1.2.210%皮肤匀浆的制备取脱毛皮肤组织0.5 g，经预冷生理盐水漂洗，除去皮下脂肪和其他结缔组织，滤纸拭干，称重，量筒量取该组织块9倍质量预冷生理盐水，用匀浆机制成10%组织匀浆（在低温环境中使组织细胞完全破碎，显微镜下观察内容物全部游离在液相中）。
1.2.3各项指标的测定皮肤匀浆中Lpf，SOD，MDA.Hyp含量或活力，均根据测试盒所附方法、步骤测定。
1.2.4皮肤中水分含量的测定采用烘干法取1 g皮肤，精密称取湿重后置烘箱中，于80℃烘干12 h，称其干重，计算皮肤含水量。
2结果
中药祛斑合剂能提高衰老模型小鼠皮肤超氧化物歧化酶（SOD）活力及羟脯氨酸（Hyp）含量和皮肤含水量；降低衰老模型小鼠皮肤组织中脂褐质（Lpf）、丙二醛（MDA）含量，且呈现剂量依赖性。提示本品具有延缓皮肤衰老作用（表1）。
3讨论
皮肤的衰老是一个复杂的生物学过程，对此有多种解释，如自由基学说、交联学说、遗传学说、免疫学说等，其中自由基学说比较被认同。机体在新陈代谢过程中，不断产生自由基，自由基攻击生物大分子，如脂质、核酸、多聚不饱和脂肪酸等，使其交联或断裂，导致细胞结构和功能的破坏，形成过氧化脂质，后者与膜脂和膜蛋白聚合，交联形成脂褐质沉积于组织中，在皮肤上形成色斑；自由基堆积还可使具有合成胶原能力的成纤维细胞受损，细胞内羟化酶失去羟化功能，羟脯氨酸的生成减少，胶原蛋白合成减少，导致皮肤皱纹形成、皮肤松弛[5-6]。
SOD是体内最重要的自由基清除剂，是唯一能特异性清除衰老启动因子O2-的抗氧化酶，提高SOD活性可抑制脂褐质的沉积[7]。MDA的水平可反应活性氧的损伤效应[8]。皮肤组织中水分含量以及SOD活力和MDA、Hyp、Lpf含量是判定受试动物皮肤衰老程度的重要指标。研究已证明D-半乳糖诱导的亚急性衰老模型是可靠的衰老实验动物模型。因此，本课题采用D-半乳糖造成小鼠皮肤亚急性衰老模型[9]。
本实验结果表明，中药祛斑合剂能提高衰老小鼠皮肤中水分含量、羟脯氨酸（Hyp）含量和超氧化物歧化酶（SOD）活力，降低衰老小鼠皮肤组织中脂褐质（Lpf）、丙二醛（MDA）含量。表明中药祛斑合剂具有一定的延缓皮肤衰老的功效。其作用机制可能是通过提高SOD活性，增强机体抗氧化能力即增强清除自由基的能力，进而抑制自由基反应，从而抑制脂质过氧化产物MDA以及Lpf的生成和积聚，减轻了对成纤维细胞和胶原蛋白的损害。
中医理论认为[10-11]皮肤衰老以及整个机体衰老的直接原因是五脏虚损、气血失调所致的正气不足。正气虚则皮肤不能得到充分的濡养滋润，防御能力下降，易受外邪的侵袭。且外邪侵袭日久，邪气盛则正气虚，可见脏腑功能低下，气血乏源，脉络瘀阻，肌肤甲错，老相丛生。故正虚邪实是皮肤衰老的主要病理机制。因此，中医延缓皮肤衰老的主要特点就是从五脏气血论治，即侧重于通过滋补五脏、调理气血、疏通经络等措施来延缓皮肤衰老。
本院皮肤科已故专家刘复兴教授是国家级名老中医学术经验继承指导老师、云南省名老中医，学术思想精深，临床经验丰富，擅于皮肤疾病的诊治，我院根据其临床经验研制的院内制剂祛斑合剂（主要成分：女贞子、旱莲草、玉竹、白芍、丹参、柴胡、玫瑰花等），具有滋补肝肾、疏肝解郁、化瘀祛斑之功效。多年来临床应用于防治黄褐斑、皮肤老化，取得较好疗效。本研究通过动物实验初步揭示其延缓皮肤衰老的作用机制，为临床应用提供实验依据。
参考文獻：
[1]丁克祥.老年人皮肤生物学年龄的标志及其评价[J].国外医学老年医学册，1999，20（3）：13l-134.
[2]周光春，李琦仙，冯丽莉，等.益寿饮延缓衰老作用的研究[J].中国实验方剂学杂志，2010，16（9）：123.
[3]袁电杰，张印发.姚春香.灵芝多糖对实验性衰老大鼠海马内NB2B表达的影响[J].中国实验方剂学杂志，2010，16（9）：147.
[4]王少康，孙桂菊，张建新，等.亚急性衰老动物模型的建立及评价[J].东南大学学报（医学版），2002，21（3）：217.220.
[5]赵俊超.皮肤衰老机制及抗衰老研究进展[J].中国老年学杂志，2008，28（12）：1146-1148.
[6]来吉祥，何聪芬，董银卯.皮肤衰老机理及延缓衰老化妆品的研究进展[J].中国美容医学，2009，18（8）：1208—1212.
[7]张洪泉，余文新.中华抗衰老医药学[M].北京：科学出版社，2000：82-113.
[8]李素云，王立芹，郑稼琳，等.自由基与衰老的研究进展[J].中国老年学杂志，2007，27（20）：2046-2047.
[9]王 倩，蔡念宁，金 力.中药延缓皮肤衰老的研究现状[J].中国美容医学，2006，15（2）：219.221.
[10]于凌.五脏与皮肤衰老的机制探源[J].中医药学刊，2002，20（6）：779-780.
[11]王诗晗.皮肤衰老中医机理探讨[J].辽宁中医杂志，2003，30（10）：799-801.
（收稿日期：2017-10-16）
摘要：目的观察中药祛斑合剂对D-半乳糖所致衰老模型小鼠皮肤相关指标的影响。方法健康昆明种小鼠60只，随机分为正常对照组、衰老模型组、祛斑合剂高、中、低剂量（12.0.6.0，3.0 mL/kg）组和维生素E组（阳性对照组），每组10只。衰老模型组、制剂高、中、低剂量组和维生素E组，颈背部皮下注射5%D-半乳糖连续6w，建立小鼠亚急性衰老模型。给药组同时灌胃给予祛斑合剂和维生素E，正常对照组和衰老模型组给予等体积纯净水。检测皮肤组织匀浆中超氧化物歧化酶（SOD）活力和丙二醛（MDA）、脂褐质（Lpf）、羟脯氨酸（Hyp）含量及皮肤水分含量。结果祛斑合剂可提高皮肤SOD活力，提高Hyp含量及皮肤水分含量；降低皮肤MDA及Lpf含量。结论祛斑合剂具有抗D-半乳糖所致小鼠皮肤衰老的作用。
关键词：中药祛斑合剂；抗皮肤衰老；抗氧化；动物实验
中图分类号：R85.5文献标志码：B文章编号：1007-2349（2018）01-0075-02
皮肤是人体最大的器官，是美容的主要对象。皮肤老化常表现为皮肤干燥、粗糙、脱屑、色斑、松弛、皱纹、皮肤萎缩、血管突显、敏感性和脆性增加等[1]。它不仅影响美观，还与脂溢性角化、基底细胞癌等多种皮肤病有着病因学的联系。因此预防和延缓皮肤衰老一直是近些年医学科学研究的热点之一。本院皮肤科已故专家（国家级名老中医学术经验继承指导老师、云南省名老中医）刘复兴教授经验方中药祛斑合剂（院内制剂），多年来临床应用于防治黄褐斑、皮肤老化，取得较好疗效。笔者采用中药祛斑合剂对抗小鼠皮肤衰老做了实验研究，现将结果报道如下。
1材料与方法
1.1实验动物及材料清洁级健康昆明种小鼠，体重18-22 g，雌雄各半，购自昆明医科大学实验动物中心，中药祛斑合剂由云南省中医医院制剂中心提供；超氧化物歧化酶（SOD）试剂盒、脂褐质Lpf试剂盒、丙二醛（MDA）试剂盒、羟脯氨酸（Hyp）试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司）；D-半乳糖（上海藍季科技发展有限公司）；维生素E（浙江医药有限公司）；其余试剂为市售分析纯。 751光栅分光光度计，RF.540荧光分光光度计，MEGAFUGE 1.0R高速台式离心机。
1.2实验方法[2-3]
1.2.1动物模型制备、分组、给药及取材选择清洁级健康昆明种小鼠60只，体重（20±2）g，雌雄不限，随机分成6组，每组10只，雌雄分笼饲养，饲养温度为18～22℃，相对湿度为45%～55%，规律光照，自由饮食，适应性饲养1 W后开始实验。随机分为正常对照组、衰老模型组、中药祛斑合剂高、中、低剂量组和维生素E组（阳性对照组），每组10只，分笼饲养。衰老模型组、制剂高、中、低剂量组和维生素E组，每日经颈背部皮下注射5%D-半乳糖25 mL/kg，建立小鼠亚急性衰老模型[4]，正常对照组每日经颈背部皮下注射等体积的生理盐水。同时祛斑合剂各组每日灌胃给予祛斑合剂（高12.0、中6.0、低3.0 mL/kg）；维生素E组每日灌胃给予维生素E 500 mg/kg；正常对照组和衰老模型组每日灌胃给予等体积纯净水，各组均连续给药6 W。第7周处死动物前1 d，所有动物两肩胛至两髂骨之间背部皮肤以10%Na2S溶液对称脱毛（面积为3 cm×3 cm）；第2天处死动物，取背部正中皮肤0.5 cm×0.5 cm大小，留取1 g待测含水量用，其余迅速冰冻保存，拟作皮肤组织匀浆及测定皮肤羟脯氨酸等指标之用，各指标所选取材部位相同。实验过程中，每5 d各鼠称重记录1次，每日观察小鼠的皮毛色泽、饮食、饮水、大小便、精神活动情况等。
1.2.210%皮肤匀浆的制备取脱毛皮肤组织0.5 g，经预冷生理盐水漂洗，除去皮下脂肪和其他结缔组织，滤纸拭干，称重，量筒量取该组织块9倍质量预冷生理盐水，用匀浆机制成10%组织匀浆（在低温环境中使组织细胞完全破碎，显微镜下观察内容物全部游离在液相中）。
1.2.3各项指标的测定皮肤匀浆中Lpf，SOD，MDA.Hyp含量或活力，均根据测试盒所附方法、步骤测定。
1.2.4皮肤中水分含量的测定采用烘干法取1 g皮肤，精密称取湿重后置烘箱中，于80℃烘干12 h，称其干重，计算皮肤含水量。
2结果
中药祛斑合剂能提高衰老模型小鼠皮肤超氧化物歧化酶（SOD）活力及羟脯氨酸（Hyp）含量和皮肤含水量；降低衰老模型小鼠皮肤组织中脂褐质（Lpf）、丙二醛（MDA）含量，且呈现剂量依赖性。提示本品具有延缓皮肤衰老作用（表1）。
3讨论
皮肤的衰老是一个复杂的生物学过程，对此有多种解释，如自由基学说、交联学说、遗传学说、免疫学说等，其中自由基学说比较被认同。机体在新陈代谢过程中，不断产生自由基，自由基攻击生物大分子，如脂质、核酸、多聚不饱和脂肪酸等，使其交联或断裂，导致细胞结构和功能的破坏，形成过氧化脂质，后者与膜脂和膜蛋白聚合，交联形成脂褐质沉积于组织中，在皮肤上形成色斑；自由基堆积还可使具有合成胶原能力的成纤维细胞受损，细胞内羟化酶失去羟化功能，羟脯氨酸的生成减少，胶原蛋白合成减少，导致皮肤皱纹形成、皮肤松弛[5-6]。
SOD是体内最重要的自由基清除剂，是唯一能特异性清除衰老启动因子O2-的抗氧化酶，提高SOD活性可抑制脂褐质的沉积[7]。MDA的水平可反应活性氧的损伤效应[8]。皮肤组织中水分含量以及SOD活力和MDA、Hyp、Lpf含量是判定受试动物皮肤衰老程度的重要指标。研究已证明D-半乳糖诱导的亚急性衰老模型是可靠的衰老实验动物模型。因此，本课题采用D-半乳糖造成小鼠皮肤亚急性衰老模型[9]。
本实验结果表明，中药祛斑合剂能提高衰老小鼠皮肤中水分含量、羟脯氨酸（Hyp）含量和超氧化物歧化酶（SOD）活力，降低衰老小鼠皮肤组织中脂褐质（Lpf）、丙二醛（MDA）含量。表明中药祛斑合剂具有一定的延缓皮肤衰老的功效。其作用机制可能是通过提高SOD活性，增强机体抗氧化能力即增强清除自由基的能力，进而抑制自由基反应，从而抑制脂质过氧化产物MDA以及Lpf的生成和积聚，减轻了对成纤维细胞和胶原蛋白的损害。
中医理论认为[10-11]皮肤衰老以及整个机体衰老的直接原因是五脏虚损、气血失调所致的正气不足。正气虚则皮肤不能得到充分的濡养滋润，防御能力下降，易受外邪的侵袭。且外邪侵袭日久，邪气盛则正气虚，可见脏腑功能低下，气血乏源，脉络瘀阻，肌肤甲错，老相丛生。故正虚邪实是皮肤衰老的主要病理机制。因此，中医延缓皮肤衰老的主要特点就是从五脏气血论治，即侧重于通过滋补五脏、调理气血、疏通经络等措施来延缓皮肤衰老。
本院皮肤科已故专家刘复兴教授是国家级名老中医学术经验继承指导老师、云南省名老中医，学术思想精深，临床经验丰富，擅于皮肤疾病的诊治，我院根据其临床经验研制的院内制剂祛斑合剂（主要成分：女贞子、旱莲草、玉竹、白芍、丹参、柴胡、玫瑰花等），具有滋补肝肾、疏肝解郁、化瘀祛斑之功效。多年来临床应用于防治黄褐斑、皮肤老化，取得较好疗效。本研究通过动物实验初步揭示其延缓皮肤衰老的作用机制，为临床应用提供实验依据。
参考文獻：
[1]丁克祥.老年人皮肤生物学年龄的标志及其评价[J].国外医学老年医学册，1999，20（3）：13l-134.
[2]周光春，李琦仙，冯丽莉，等.益寿饮延缓衰老作用的研究[J].中国实验方剂学杂志，2010，16（9）：123.
[3]袁电杰，张印发.姚春香.灵芝多糖对实验性衰老大鼠海马内NB2B表达的影响[J].中国实验方剂学杂志，2010，16（9）：147.
[4]王少康，孙桂菊，张建新，等.亚急性衰老动物模型的建立及评价[J].东南大学学报（医学版），2002，21（3）：217.220.
[5]赵俊超.皮肤衰老机制及抗衰老研究进展[J].中国老年学杂志，2008，28（12）：1146-1148.
[6]来吉祥，何聪芬，董银卯.皮肤衰老机理及延缓衰老化妆品的研究进展[J].中国美容医学，2009，18（8）：1208—1212.
[7]张洪泉，余文新.中华抗衰老医药学[M].北京：科学出版社，2000：82-113.
[8]李素云，王立芹，郑稼琳，等.自由基与衰老的研究进展[J].中国老年学杂志，2007，27（20）：2046-2047.
[9]王 倩，蔡念宁，金 力.中药延缓皮肤衰老的研究现状[J].中国美容医学，2006，15（2）：219.221.
[10]于凌.五脏与皮肤衰老的机制探源[J].中医药学刊，2002，20（6）：779-780.
[11]王诗晗.皮肤衰老中医机理探讨[J].辽宁中医杂志，2003，30（10）：799-801.
（收稿日期：2017-10-16）
