金线莲茎段组织培养技术的研究
陆素君
摘要：利用组织培养培技术对金线莲茎段组培苗进行研究试验。结果表明：以金线莲茎段为外植体，用0.1%升汞溶液消毒10min效果比较好，杀伤力小，容易获得无菌材料，消毒之前剥开叶柄基部鞘状抱茎消毒效果好；芽增殖培养基用MS+糖30g·L-1+琼脂粉4.5g·L-1+马铃薯汁10g·L-1+激素以6-BA3.0mg·L-1+NAA0.5mg·L-1有利于金线莲的增殖与生长；在生根阶段以1/2MS+糖30g·L-1+琼脂粉4.5g·L-1+马铃薯汁10g·L-1+活性炭0.5g·L-1+NAA1.Omg·L-1效果最理想，生根率达95%，根系发达，叶子展开墨绿色；种植理想的基质为泥炭土：椰糠：细沙=5：3：2，种植成活率高达97%，幼苗生长旺盛。
关键词：金线莲茎段；组织培养；快速繁殖
中图分类号：S567.23+9 文献标识码：A 文章编号：1004-3020（2016）03-0023-04
金线莲Anoectochilus formosanus兰科Or-chidaceae开唇兰属Anoectochilus多年生草本植物。别名金线兰、金丝草、树草莲、金线仔草、金线虎头蕉、金线入骨消等。在民间具有广泛药用价值，素有“药王”、“金草”、“神草”、“鸟人参”等美称。营养成份中氨基酸和微量元素两者的含量均高于国产西洋参和野山参；它们与牛磺酸、多糖类成分具有营养、抗衰老、养肝护肝、调节人体机体免疫的作用。分布在福建、台湾、广东、广西、海南、四川、贵州、云南等亚热带及热带。金线莲性喜阴凉、潮湿，尤其喜欢生长在有常绿阔叶树木的沟边、石壁、土质松散的潮湿地带，要求温度20～32℃，光照约为正常日照的1/3，最忌阳光直射。由于金线莲在自然界的蕴藏量已很稀少，因此，人工种植金线莲有利于保护濒危药用植物的生存与繁殖。对金线莲进行茎段组培育苗快速繁殖及种植的研究，为金线莲组培育苗工厂化生产提供参考依据。
1 试验材料来源
外植体诱导试验材料采用广西壮族自治区博白县那林镇林区的野生金线莲。诱导获得无菌材料后开展培养基调试。
2 试验方法
2.1 外植体诱导
将采回来的金线莲外植体在自来水下冲洗去表面的灰尘，用剪刀把外植体叶子部分按两种剪法处理：一种是只剪叶子，未剥掉叶柄基部鞘状茎；另一种是全部剥掉叶柄基本鞘状茎。然后分别从上至下分成三节茎段，每段必需带1～2个节眼，用去离子水漂洗3～4次。置于超净台上，在无菌的条件下，用75%的乙醇进行表面消毒10，用无菌水漂洗4～5次，然后0.1%升汞溶液分别消毒5，10，15min不断搅拌。用无菌水漂洗4～5次，剪掉茎段及叶柄处被药物损伤的部分，接种于起动培养基上，每一消毒处理接种40支试管，每支接种1个芽。
2.2 生产培养基调试
2.2.1 基本培养基选择
用无菌的组培瓶苗作转接材料，分别以MS，N6，B5三种培养基为基本培养基，添加：6-BA1.0mg·L-1+NAA0.5mg·L-1+糖30g·L-1+琼脂粉6g·L-1+马铃薯汁10g·L-1，每一培养基接种10瓶，接种50d观察生长情况。
2.2.2 不同激素配比对金线莲组培苗增殖的影响
选择上述试验表现最好的培养基基本培养基，添加不同比例的激素配比，6-BA分别为0.5，1.0，2.0，3.0，4.0mg·L-1，NAA为0.5mg·L-1，培养基中添加糖30g·L-1+琼脂粉6g·L-1+马铃薯汁10g·L-1，每一激素配比接种10瓶，每次接种后50d观察芽分化情况。
2.2.3 不同生长素对金线莲生根的影响
选择上述试验表现最好的培养基分别以全大量、1/2大量为生根基本培养基，分别添加IBA、NAA、IBA+NAA3种激素处理，每一处理分别设计0.5，1.0，2.0mg·L-13个水平，添加糖30g·L-1+琼脂粉6g·L-1+马铃薯汁10g·L-1+活性炭0.5g·L-1，每一培养基接种10瓶，每瓶插苗10株。接种50d后检查生根情况及根系的发达情况。
2.2.4 不同的添加物对金线莲组培苗的影响
选择上述试验金线莲生根表现最好的培养基为基本培养基，添加物分别为对照0g·L-1；香蕉10g·L-1、20g·L-1；马铃薯10g·L-1、20g·L-1，观察瓶苗生长情况。
2.2.5 培养条件
以上每一试验均重复3次，所用培养基pH值为5.5。培养基消毒灭菌为恒温121℃，恒压1.1个大气压，时间15min。培养条件为自然光照，温度为25±1℃，湿度70%～80%。
2.3 组培苗种植
①泥炭土；②泥炭土：椰糠：细沙=5：3：2用0.5%的高锰酸钾溶液消毒备用。将生根的小苗搬到培养室外，炼苗3～5d，使其适应外界环境。种植时用镊子轻轻夹出生根苗，用清水将培养基洗干净，移栽到消毒好的基质，淋足定根水。种植后注意保持基质湿润，注意遮阳，一般透光率为30%左右。一星期后可喷0.1%磷酸二氢钾溶液叶面肥，连续喷洒4次。以后可淋30%的沼气水。病虫害防治可用多菌灵、托布津等杀菌剂1000倍液进行防治。
3 试验结果分析
3.1 修剪处理及消毒时间对金线莲外植体的影响
从表1可以看出：金线莲外植体叶柄基部鞘状抱茎对消毒效果影响非常大，未剥掉叶柄基部鞘状抱茎用0.1%升汞溶液消毒515的获得率为零，全部污染。而经过全剥掉叶柄基部鞘状茎消毒效果会好一些，同是用0.1%升汞溶液消毒10第二段枝条的获得率达37.5%。从试验中还观察到污染的材料主要是霉菌，这与金线莲生长在阴暗潮湿的环境以及它的叶柄基部鞘状抱茎有关。
3.2 基本培养基对金线莲生长的影响
从试验结果观察到三种基本培养对金线莲组培育苗有明显的作用，效果依次为MS>B5>N6。MS培养基能使苗木抽高达6.1cm，增殖倍数有3.0，芽分化正常，节间正常，叶子展开。后面以MS为基本培养基进行相关的试验。
3.3 不同激素配比对金线莲组瓶苗增殖的影响
以MS为基本培养基，分别添加6=BA：0.5，1.0，2.0，3.0，4.0mg·L-1，NAA为0.5mg·L-1，试验观察到NAA的用量不变，随着6-BA的浓度增高，金线莲的芽增殖倍数增高，在6-BA为3.0mg·L-1时效果最佳，增殖倍数达6.6，节间正常，叶子展开（见图1）。但6-BA上升到4.0mg·L-1时，芽增殖倍数变化不大，叶子出现了卷曲及水渍状，节抽得变长。
3.4 不同生长素对金线莲生根的影响
试验以全量MS、1/2MS培养基为金线莲生根基本培养基，添加了生长素IBA、NAA、IBA+NAA。从表4结果看出，以1/2MS为生根基本培养基，单独添加生长素NAA效果理想，以浓度为1.0mg·L-1效果最佳，生根率达100%，根系发达，叶子展开墨绿色，苗长得快，50d平均高度有6.1cm，根系长2.8cm，有利于种植（见图2）。
3.5 不同的添加物对金线莲的影响
从表5可以看出：添加香蕉汁、马铃薯汁对金线莲组培苗生根起到很大的作用，不加有添加物的对照组苗木生根率低，根系短，叶子红，而加有马铃薯汁的最好，用量在10～20g·L-1都可以，根系发达，生根率达到100%，叶子墨绿色，叶脉明显。
3.6 不同的基质对金线莲苗木生长的影响
金线莲喜阴湿肥沃的生长环境，根据此特性在种植上用两种配比的基质进行种植。从表6可以看出：泥炭土：椰糠：细沙=5：3：2的配方有利于金线莲组培苗的生长，此配方基质疏松透气，种植成活率高达97%，幼苗生长旺盛。纯泥炭土的配方容易积水板结，不利于幼苗的生长。
4 结论与讨论
（1）金线莲茎段外植体消毒用0.1%升汞溶液消毒10min效果比较好，杀伤力小，容易获得无菌材料。消毒之前要剥开叶柄基部鞘状抱茎，可以提高消毒效果。
（2）金线莲组培育苗继代培养基用MS+糖30g·L-1+琼脂粉4.5g·L-1+马铃薯汁10g·L-1为基本培养基，激素组合6-BA3.0mg·L-1+NAA0.5mg·L-1和6-BAl.0mg·L-1+NAA0.5mg·L-1都有利于金线莲的增殖与生长，在生产中可以高低激素互相交换使用效果更加理想。
（3）矿物元素浓度较高时有利于发展茎叶，而较低时有利于生根。在金线莲组培育苗生根阶段大量元素减半有利于诱导根系的生长，以1/2MS培养基为生根基本培养基，添加糖30g·L-1、琼脂粉4.5g·L-1、马铃薯汁10g·L-1、活性炭0.5g·L-1，NAA1.0mg·L-1效果最理想，生根率达100%，根系发达，叶子展开绿色，苗长得快，50d左右可以进行种植。
（4）在金线莲生根培养基中添加马铃薯汁的用量在10～20g·L-1都可以，根系发达，生根率达到95%以上，但从成本上考虑大量生产可以用10g·L-1。
（5）金线莲种植理想的基质为：泥炭土：椰糠：细沙=5：3：2。此配方有利于金线莲组培苗的生长，基质疏松透气，种植成活率高达97%，幼苗生长旺盛。在种植中选择阴凉地种植，遮阴度60%～70%，注意水分的保持。
（6）野生金线莲非常少，我们在采集外植体时注意基因的收集与保护。
（责任编辑：郑京津）
摘要：利用组织培养培技术对金线莲茎段组培苗进行研究试验。结果表明：以金线莲茎段为外植体，用0.1%升汞溶液消毒10min效果比较好，杀伤力小，容易获得无菌材料，消毒之前剥开叶柄基部鞘状抱茎消毒效果好；芽增殖培养基用MS+糖30g·L-1+琼脂粉4.5g·L-1+马铃薯汁10g·L-1+激素以6-BA3.0mg·L-1+NAA0.5mg·L-1有利于金线莲的增殖与生长；在生根阶段以1/2MS+糖30g·L-1+琼脂粉4.5g·L-1+马铃薯汁10g·L-1+活性炭0.5g·L-1+NAA1.Omg·L-1效果最理想，生根率达95%，根系发达，叶子展开墨绿色；种植理想的基质为泥炭土：椰糠：细沙=5：3：2，种植成活率高达97%，幼苗生长旺盛。
关键词：金线莲茎段；组织培养；快速繁殖
中图分类号：S567.23+9 文献标识码：A 文章编号：1004-3020（2016）03-0023-04
金线莲Anoectochilus formosanus兰科Or-chidaceae开唇兰属Anoectochilus多年生草本植物。别名金线兰、金丝草、树草莲、金线仔草、金线虎头蕉、金线入骨消等。在民间具有广泛药用价值，素有“药王”、“金草”、“神草”、“鸟人参”等美称。营养成份中氨基酸和微量元素两者的含量均高于国产西洋参和野山参；它们与牛磺酸、多糖类成分具有营养、抗衰老、养肝护肝、调节人体机体免疫的作用。分布在福建、台湾、广东、广西、海南、四川、贵州、云南等亚热带及热带。金线莲性喜阴凉、潮湿，尤其喜欢生长在有常绿阔叶树木的沟边、石壁、土质松散的潮湿地带，要求温度20～32℃，光照约为正常日照的1/3，最忌阳光直射。由于金线莲在自然界的蕴藏量已很稀少，因此，人工种植金线莲有利于保护濒危药用植物的生存与繁殖。对金线莲进行茎段组培育苗快速繁殖及种植的研究，为金线莲组培育苗工厂化生产提供参考依据。
1 试验材料来源
外植体诱导试验材料采用广西壮族自治区博白县那林镇林区的野生金线莲。诱导获得无菌材料后开展培养基调试。
2 试验方法
2.1 外植体诱导
将采回来的金线莲外植体在自来水下冲洗去表面的灰尘，用剪刀把外植体叶子部分按两种剪法处理：一种是只剪叶子，未剥掉叶柄基部鞘状茎；另一种是全部剥掉叶柄基本鞘状茎。然后分别从上至下分成三节茎段，每段必需带1～2个节眼，用去离子水漂洗3～4次。置于超净台上，在无菌的条件下，用75%的乙醇进行表面消毒10，用无菌水漂洗4～5次，然后0.1%升汞溶液分别消毒5，10，15min不断搅拌。用无菌水漂洗4～5次，剪掉茎段及叶柄处被药物损伤的部分，接种于起动培养基上，每一消毒处理接种40支试管，每支接种1个芽。
2.2 生产培养基调试
2.2.1 基本培养基选择
用无菌的组培瓶苗作转接材料，分别以MS，N6，B5三种培养基为基本培养基，添加：6-BA1.0mg·L-1+NAA0.5mg·L-1+糖30g·L-1+琼脂粉6g·L-1+马铃薯汁10g·L-1，每一培养基接种10瓶，接种50d观察生长情况。
2.2.2 不同激素配比对金线莲组培苗增殖的影响
选择上述试验表现最好的培养基基本培养基，添加不同比例的激素配比，6-BA分别为0.5，1.0，2.0，3.0，4.0mg·L-1，NAA为0.5mg·L-1，培养基中添加糖30g·L-1+琼脂粉6g·L-1+马铃薯汁10g·L-1，每一激素配比接种10瓶，每次接种后50d观察芽分化情况。
2.2.3 不同生长素对金线莲生根的影响
选择上述试验表现最好的培养基分别以全大量、1/2大量为生根基本培养基，分别添加IBA、NAA、IBA+NAA3种激素处理，每一处理分别设计0.5，1.0，2.0mg·L-13个水平，添加糖30g·L-1+琼脂粉6g·L-1+马铃薯汁10g·L-1+活性炭0.5g·L-1，每一培养基接种10瓶，每瓶插苗10株。接种50d后检查生根情况及根系的发达情况。
2.2.4 不同的添加物对金线莲组培苗的影响
选择上述试验金线莲生根表现最好的培养基为基本培养基，添加物分别为对照0g·L-1；香蕉10g·L-1、20g·L-1；马铃薯10g·L-1、20g·L-1，观察瓶苗生长情况。
2.2.5 培养条件
以上每一试验均重复3次，所用培养基pH值为5.5。培养基消毒灭菌为恒温121℃，恒压1.1个大气压，时间15min。培养条件为自然光照，温度为25±1℃，湿度70%～80%。
2.3 组培苗种植
①泥炭土；②泥炭土：椰糠：细沙=5：3：2用0.5%的高锰酸钾溶液消毒备用。将生根的小苗搬到培养室外，炼苗3～5d，使其适应外界环境。种植时用镊子轻轻夹出生根苗，用清水将培养基洗干净，移栽到消毒好的基质，淋足定根水。种植后注意保持基质湿润，注意遮阳，一般透光率为30%左右。一星期后可喷0.1%磷酸二氢钾溶液叶面肥，连续喷洒4次。以后可淋30%的沼气水。病虫害防治可用多菌灵、托布津等杀菌剂1000倍液进行防治。
3 试验结果分析
3.1 修剪处理及消毒时间对金线莲外植体的影响
从表1可以看出：金线莲外植体叶柄基部鞘状抱茎对消毒效果影响非常大，未剥掉叶柄基部鞘状抱茎用0.1%升汞溶液消毒515的获得率为零，全部污染。而经过全剥掉叶柄基部鞘状茎消毒效果会好一些，同是用0.1%升汞溶液消毒10第二段枝条的获得率达37.5%。从试验中还观察到污染的材料主要是霉菌，这与金线莲生长在阴暗潮湿的环境以及它的叶柄基部鞘状抱茎有关。
3.2 基本培养基对金线莲生长的影响
从试验结果观察到三种基本培养对金线莲组培育苗有明显的作用，效果依次为MS>B5>N6。MS培养基能使苗木抽高达6.1cm，增殖倍数有3.0，芽分化正常，节间正常，叶子展开。后面以MS为基本培养基进行相关的试验。
3.3 不同激素配比对金线莲组瓶苗增殖的影响
以MS为基本培养基，分别添加6=BA：0.5，1.0，2.0，3.0，4.0mg·L-1，NAA为0.5mg·L-1，试验观察到NAA的用量不变，随着6-BA的浓度增高，金线莲的芽增殖倍数增高，在6-BA为3.0mg·L-1时效果最佳，增殖倍数达6.6，节间正常，叶子展开（见图1）。但6-BA上升到4.0mg·L-1时，芽增殖倍数变化不大，叶子出现了卷曲及水渍状，节抽得变长。
3.4 不同生长素对金线莲生根的影响
试验以全量MS、1/2MS培养基为金线莲生根基本培养基，添加了生长素IBA、NAA、IBA+NAA。从表4结果看出，以1/2MS为生根基本培养基，单独添加生长素NAA效果理想，以浓度为1.0mg·L-1效果最佳，生根率达100%，根系发达，叶子展开墨绿色，苗长得快，50d平均高度有6.1cm，根系长2.8cm，有利于种植（见图2）。
3.5 不同的添加物对金线莲的影响
从表5可以看出：添加香蕉汁、马铃薯汁对金线莲组培苗生根起到很大的作用，不加有添加物的对照组苗木生根率低，根系短，叶子红，而加有马铃薯汁的最好，用量在10～20g·L-1都可以，根系发达，生根率达到100%，叶子墨绿色，叶脉明显。
3.6 不同的基质对金线莲苗木生长的影响
金线莲喜阴湿肥沃的生长环境，根据此特性在种植上用两种配比的基质进行种植。从表6可以看出：泥炭土：椰糠：细沙=5：3：2的配方有利于金线莲组培苗的生长，此配方基质疏松透气，种植成活率高达97%，幼苗生长旺盛。纯泥炭土的配方容易积水板结，不利于幼苗的生长。
4 结论与讨论
（1）金线莲茎段外植体消毒用0.1%升汞溶液消毒10min效果比较好，杀伤力小，容易获得无菌材料。消毒之前要剥开叶柄基部鞘状抱茎，可以提高消毒效果。
（2）金线莲组培育苗继代培养基用MS+糖30g·L-1+琼脂粉4.5g·L-1+马铃薯汁10g·L-1为基本培养基，激素组合6-BA3.0mg·L-1+NAA0.5mg·L-1和6-BAl.0mg·L-1+NAA0.5mg·L-1都有利于金线莲的增殖与生长，在生产中可以高低激素互相交换使用效果更加理想。
（3）矿物元素浓度较高时有利于发展茎叶，而较低时有利于生根。在金线莲组培育苗生根阶段大量元素减半有利于诱导根系的生长，以1/2MS培养基为生根基本培养基，添加糖30g·L-1、琼脂粉4.5g·L-1、马铃薯汁10g·L-1、活性炭0.5g·L-1，NAA1.0mg·L-1效果最理想，生根率达100%，根系发达，叶子展开绿色，苗长得快，50d左右可以进行种植。
（4）在金线莲生根培养基中添加马铃薯汁的用量在10～20g·L-1都可以，根系发达，生根率达到95%以上，但从成本上考虑大量生产可以用10g·L-1。
（5）金线莲种植理想的基质为：泥炭土：椰糠：细沙=5：3：2。此配方有利于金线莲组培苗的生长，基质疏松透气，种植成活率高达97%，幼苗生长旺盛。在种植中选择阴凉地种植，遮阴度60%～70%，注意水分的保持。
（6）野生金线莲非常少，我们在采集外植体时注意基因的收集与保护。
（责任编辑：郑京津）
