基于不同链长DNA金纳米粒子的阵列比色传感器对多种重金属离子的鉴别
边孟孟 徐梦 袁亚利 聂瑾芳
摘要构建了一种基于DNA金纳米粒子（DNAAuNPs）的无标记比色阵列传感器，用于多种金属离子的鉴别。以不同长度单链DNA（ssDNA）链（15A、 30A和45AT）作为非特异性受体，分别与AuNPs结合，构成3个复合体系（15A DNAAuNPs、30A DNAAuNPs、45AT DNAAuNPs），作为此传感器的3个阵列传感元件。在高浓度盐的存在下，不同的金属离子可触发DNA保护的AuNPs显示出不同的聚集行为并呈现各种颜色变化。以紫外可见吸收光谱作为传感器的响应信号，通过主成分分析（PCA）和线性判别分析（LDA）对此比色传感器的响应信号进行分析。实验结果表明， 11种不同重金属离子（Ag+、Pb2+、Zn2+、Cu2+、Cd2+、Mn2+、Ni2+、Co2+、Hg2+、Bi3+、Cr3+）在0.5 μmol/L水平下，通过LDA可得到很好的区分。
关键词DNA金纳米粒子; 化学计量学; 多维比色传感器; 重金属离子
1引 言
近年来，由于人类活动导致的铅、汞、锌、铜、铁等各种重金属[1]的过度使用及排放日益加剧，通过空气、水、食物等方式进入人体，并在体内积累[2]。虽然微量重金属元素可调节机体内的生物酶活性，增进宏量元素在体内的传输[3]，但过量重金属可抑制酶的活性，破坏正常的生物化学反应，产生遗传毒性、生殖毒性等，极大地影响人类健康和社会可持续发展[4～6]。重金属离子通常以混合物的形式存在于环境中，已有研究表明，当多种重金属离子同时存在时， 常表现出协同毒性[7]。因此，对于多种重金属离子同时检测具有重要的意义。
目前，检测重金属离子的传统方法包括原子荧光光谱法（AFS）[8]、原子发射光谱法（AAS）[9]、电感耦合等离子体质谱法（ICPMS）[10]等，分析的准确度、精密度和灵敏度均可达到国家标准检测要求，而且可实现重金属离子的同时检测。然而，传统的检测技术从采样到检测的全程耗时较长，检测多使用大型设备，成本较高，难以实现现场定量或定性分析。
近年来，多维传感器在检测重金属方面取得较大进展[11]。多维传感器使用阵列传感器，改变了一个传感器只对应一种分析物的模式，通过利用多维传感器的综合效应对每个分析物产生独特的响应模式，从而获得一系列目标物之间的差异，可检测和区分多种分析物[12]。多维传感器解决了传统仪器检测中需要大型仪器、仪器操作需专业人员、检测成本高、检测时间长、过程繁琐等问题，在灵敏度、选择性、多重检测能力和便携性方面具有显著优势。
Cao等[13]报道了一种丹磺酰官能化荧光膜传感器，实现了Cu2+和Hg2+的识别。Wu等[14]设计了4种具有普通聚对苯乙烯亚乙炔基（PPE）主链和不同离子侧链的阴离子共轭聚电解质（CPE），通过4种PPE传感器阵列的荧光强度响应模式，同时区分8种金属离子。这些方法有效提高了重金属检测效率，但用于传感器的材料需要通过复杂的化学合成和繁杂的处理步骤，仍存在局限性。此类具有多维信息的材料难以设计或合成，而现有的基于纳米材料的传感器大多只有一个传感元件。由于传感器的分辨能力严重依赖于传感元件的个数，因此，这些单传感元件的传感器因分辨能力有限而限制了其广泛应用[15]。开发具有不同传感能力且易于制备的新材料是解决上述问题的关键。
DNA与金纳米粒子（AuNPs）的组合为可扩展的多维传感器的开发提供了解决方案。DNA易于合成，以DNA作为传感器元件不仅可很好地解决上述传感器材料合成困难的问题，同时，DNA碱基序列排列的多样性也为多维传感器识别多种分析物提供了更多的可能性[16]。AuNPs是制备多维传感器的潜在纳米材料，如将具有多维信息的DNA结合到纳米材料上，就可能构建出具有无限感应元件的多维传感器。AuNPs因具有独特的光学性质、良好的生物兼容性和易于进行表面修饰等优点，在生物传感器中被广泛应用[17]。目前，已有很多种制备AuNPs的成熟方法，如溶剂还原法、水热法、微波合成法等，这些制备方法都比较简单; AuNPs的物理化学性质，如等离子体共振吸收、吸收光谱、荧光猝灭效率和电导率，可通过识别元件与分析物之间的结合而改变，从而产生可被检测的响应信号[18]。通过合理的设计，基于DNAAuNPs的多维传感器，具有无限感测元件和出色的辨别能力。
Sun等[19]设计了一种以DNAAuNPs为传感元件的鉴别蛋白质的双通道（荧光、比色）三维传感器，可区分浓度为50 nmol/L的11種蛋白质，准确度达到100%，而且可同时区分两种具有不同浓度和物理化学性质的蛋白质和不同摩尔比的混合物。然而，此传感器阵列需要3种FAM标记的DNA 序列作为识别元件。2017年，Wei等[20]仅用两种无标记的ssDNA（15A和30A）作为受体阵列，依据不同的蛋白质可触发DNA保护的AuNPs，显示出不同的聚集行为以及各种颜色变化，开发了一种简易的单通道二维比色传感器，在50 nmol/L水平下，裸眼即可很好地区分12种蛋白质，相似的蛋白质混合物和未知样品的区分精度均能达到100%。相比于Sun等[19]的研究，Wei等[20]设计的传感器操作更便捷，识别性能更佳。在已报道的大部分文献中，基于DNAAuNPs的多维传感器主要应用于蛋白质的鉴别和检测。Tan等[21]首次利用DNAAuNPs复合体系构建了一种双通道（比色和荧光）多维传感器，可同时检测和鉴别9种重金属离子，但此传感器比较复杂，不仅需要采用3种FAM标记的DNA，同时需要荧光和比色两种方法，检测步骤比较繁琐。
为了构建一种简易的、无标记的单通道多维比色传感器，实现多种重金属离子的同时鉴别，本研究建立了一种无标记的重金属离子鉴别方法。基于DNAAuNPs复合体系，在高浓度盐的存在下，不同的金属离子可引起不同DNA保护的AuNPs显示出不同的聚集行为，并呈现各种颜色变化，构建了一种简易的用于鉴别重金属离子的比色传感器。此比色传感器由3个DNAAuNPs复合体系构成，分别为15A DNAAuNPs、30A DNAAuNPs和45AT DNAAuNPs，与11种重金属离子产生不同的比色响应信号（吸光度变化）。以625和519 nm处的吸光度的比值K（K=A625 nm/A519? nm）量化AuNPs的聚集程度，结合主成分分析法（PCA）和线性判别分析（LDA），此传感器可区分11种重金属离子。
2实验部分
2.1仪器与试剂
TU1901紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限公司）; PHS3C数显酸度计（杭州奥利龙仪器有限公司）; EL204电子天平（梅特勒托利多仪器（上海）有限公司）; ZS90全自动电位图像分析仪（南宁蓝天科技设备）。
HAuCl4（99.9%，国药集团试剂有限公司）; 15A、30A、45AT的DNA（HPLC纯化，生工生物工程（上海）有限公司合成）。其它药品和剂均为分析纯; 实验用为二次蒸馏水。
2.2AuNPs的制备
采用柠檬酸三钠还原法制备AuNPs [20]。首先，在250 mL圆底烧瓶中加入100 mL 1 mmol/L HAuCl4溶液，加热至沸腾，在搅拌状态下快速加入10 mL 38.8 mmol/L柠檬酸三钠溶液，在搅拌下继续加热15 min，溶液逐渐变成酒红色。冷却至室温，即制得柠檬酸根保护的AuNPs，于4℃保存。
2.3DNAAuNPs的制备
DNA用pH=7.4的PBS缓冲溶液配制成1 μmol/L的溶液，于95℃加热5 min，然后逐渐冷却至室温。将90 μL 1 μmol/L DNA 与600 μL AuNPs溶液混合，室温孵育12 h，得到DNAAuNPs。
2.4金属离子的鉴别
将90 μL一定浓度的金属离子溶液加入630 μL DNAAuNPs溶液中，在37℃下反应30 min，促进DNAAuNPs与金属离子的结合。向上述混合物中加入180 μL 120 mmol/L NaCl溶液，检测体系的紫外可见吸收光谱。所获得的光谱数据用主成分分析（PCA）和线性判别分析（LDA）方法处理。经典的PCA和LDA程序在MATLAB环境下编写和运行，实现分类数据特征的提取。对实验中得到的11种金属离子的吸光度比值K及紫外可见吸收光谱进行整理，构成一定空间的矩阵。PCA和LDA这两种模式识别方法可以此为基础提取第一第二特征向量（及第三特征向量），对11重金属离子进行区分鉴别。所得数据结果图中的坐标轴即为提取的特征向量（即主成分矢量）。
3结果与讨论
3.1实验原理
基于DNAAuNPs的比色传感器以3种无标记、非特异性的DNA序列（15A、30A、45AT）作为传感元件，鉴别不同的重金属离子，原理如图1所示。柠檬酸三钠还原法合成的AuNPs表面吸附了大量的柠檬酸根负离子，AuNPs粒子间因静电斥力而在溶液中保持分散状态。加入DNA后，DNA链上的碱基通过非共价作用吸附在AuNPs表面，DNA带负电的磷酸盐骨架增加了AuNPs表面的负电性，使得AuNPs在高盐浓度下不发生团聚，对AuNPs具有保护作用。当加入金属离子时，一方面，带正电的金属离子中和了碱基上磷酸基团所带的负电荷; 另一方面，金属离子与DNA的碱基发生相互作用，从而使DNA的保护作用被削弱，DNAAuNPs复合体系的稳定状态被破坏，导致在高盐浓度下AuNPs发生聚集，AuNPs溶液颜色也发生变化。不同的金属离子与DNA的相互作用强弱不同，影响AuNPs的聚集程度及其颜色变化。合成的AuNPs在分散状态下呈酒红色，最大吸收波长约520 nm。当AuNPs溶液发生聚集时，随着聚集程度增大，溶液由酒红色变为紫色、蓝色甚至灰色，此时溶液最大吸收波长红移。以分别代表AuNPs分散状态和聚集状态时519 nm和625 nm处的吸收强度比值K（K=A625 nm/A519? nm）衡量AuNPs的聚集程度，K值越大，AuNPs的聚集程度越严重，以此鉴别不同的重金属离子。
3.2AuNPs的表征
AuNPs的粒径大小及均一性均可能影响实验结果。合成的AuNPs的紫外可见吸收光谱如图2A所示，特征吸收峰在519 nm处，且吸收峰尖锐，表明粒径分布比较均匀[23]。利用全自动电位图像分析仪对合成的AuNPs进行分析，结果如图2B所示，AuNPs的直径约为21 nm，粒径较均匀。
3.3NaCl濃度的优化
溶液的离子强度是影响AuNPs稳定性的因素之一[24]。本传感体系中，AuNPs聚集程度随着NaCl的浓度增大而增大，当NaCl浓度很低时，AuNPs可长时间保持稳定，不发生聚集。然而，如果NaCl浓度过高，DNA 保护的AuNPs也会发生明显的聚集行为，影响传感器对金属离子的鉴别能力[25]。因此，选择合适的盐浓度尤为重要。如图3所示，对于没有DNA保护的AuNPs、15AAuNPs和30AAuNPs，分别以NaCl浓度变化对吸光比值K（K=A625 nm/A519 nm）作图，由图3可见，当加入浓度为120 mmol/L的NaCl溶液时， AuNPs和15AAuNPs之间以及AuNPs和30AAuNPs之间的K值差异达到最大值。因此，在后续实验中选择加入的NaCl溶液浓度均为120 mmol/L。此外，30个碱基DNA对AuNPs的保护效果优于15个碱基DNA，推测更长序列的DNA对AuNPs保护效果更好。因此在后续实验中还引入了45个碱基的DNA，增加了传感器的传感元件，检验其是否可更好地实现对金属离子的鉴别。
3.4金属离子的鉴别
3.4.1可行性实验为了证明本比色传感体系的可行性， 将11种常见重金属离子（Ag+、Pb2+、Zn2+、Cu2+、Cd2+、Mn2+、Ni2+、Co2+、Hg2+、Bi3+、Cr3+）分别加入15A DNAAuNPs和30A DNAAuNPs体系中，各金属离子的浓度均为10 μmol/L。如图4A所示，
不同金属离子加入两种不同DNA保护的AuNPs体系时，AuNPs发生聚集的程度不同，产生特定的颜色变化， 裸眼即可辨别。通过测定溶液的吸收光谱，计算每种金属离子在两个体系中的K值。由图4B可见，不同重金属离子在15AAuNPs和30AAuNPs体系中有特征的响应值K，证明此传感器用于多种重金属离子鉴别的可行性。
3.4.2PCA分析（1）二维比色在最佳实验条件下，将11种浓度各为0.5 μmol/L金属离子（Ag+、Pb2+、Zn2+、Cu2+、Cd2+、Mn2+、Ni2+、Co2+、Hg2+、Bi3+、Cr3+）依次加入15A DNAAuNPs和30A DNAAuNPs溶液中，測定各个反应液的吸收光谱，得到22个响应信号，以K值表示，每一个样品平行实验次数为4次，最终获得88个K值。
PCA是一种基于变量之间线性组合计算的建模方法，可解释数据中的最大方差。此方法可对原始光谱变量进行转换，得到的新变量能最大限度地表征原变量的数据结构特征，通常2个或3个主成分的累计方差足以解释总方差，从而实现数据的降维[22]。利用PCA方法对比色传感器获得的88个响应K值进行判别分析，图5为前2个主成分PCA1和PCA2组成的二维空间图，图5中的各个点对应为每个分析样品的2个传感元件（15A、30A）响应值的二维数据坐标位点。在PCA二维散点图中，大多数样本点集中在图5的右侧区域内，少数10个样本点分布于图5的左侧区域，同一类样本点分散开，不同类样本点间相互交叉或重叠，没有达到聚类效果。
（2）三维比色通过分析图5数据发现，由两个传感元件（15A DNA和30A DNA）构成的二维传感器对11种重金属的鉴别能力较差，而传感器的分辨能力与传感元件的个数密切相关。因此，本研究增加另一条DNA链（45AT）作为传感器第3个传感元件。在最佳实验条件下，将11种浓度为1 μmol/L的金属离子（Ag+、Pb2+、Zn2+、Cu2+、Cd2+、Mn2+、Ni2+、Co2+、Hg2+、Bi3+、Cr3+）分别依次加入3个体系（15A DNAAuNPs、30A DNAAuNPs和45AT DNAAuNPs）中反应，测量吸收光谱，产生33个响应信号，分别进行4次平行实验，最终获得132个响应信号和132个K值。
以每个样品平行实验4次测得响应值K的平均值（K0）作图，如图6A所示，不同的分析目标物的K值不同，即每种分析物都有对应的特征响应值。当相同浓度的同一金属离子加入到15A DNAAuNPs、30A DNAAuNPs和45AT DNAAuNPs体系中，15A DNAAuNPs 体系的响应值K明显大于其余两个体系，30A DNAAuNPs 体系所获得响应值略大于45AT DNAAuNPs。K值越大，表明AuNPs聚集程度越大，DNA对AuNPs的保护作用越弱。此结果也说明，DNA对AuNPs的保护作用与DNA链长度有关。在一定程度上，DNA链越长，对AuNPs的保护能力越强。其中，Zn2+在30A DNAAuNPs中的K值明显小于在45AT DNAAuNPs中，说明45AT DNA对AuNPs的保护作用弱于30A DNA。推测原因是45AT DNA中有22个A碱基，23个T碱基，Zn2+与T碱基的相互作用强于A碱基，因此相对于30A DNA，45AT DNA对AuNPs的保护作用减弱，导致其聚集程度加大。
将比色传感器获得的132个响应K值数据通过PCA方法进行分析，结果如图6B和6C所示。图6B是前2个主成分PCA1和PCA2组成的二维空间图，各个点对应每个分析样品的3个传感元件（15A、30A、45AT）响应值的二维数据坐标位点。在PCA二维散点图中，大多数样本点集中图的右侧区域内，少数样本点分布于图的左侧区域，分辨能力相对于二维传感器没有明显优势，其聚类效果依然较差。
为此增加PCA散点图的维度，减少信号响应值在数据处理中信息缺失的可能，图6C给出了前3个主成分PCA1、PCA2和PCA3组成的三维空间图，图中的各个点对应为每个分析样品的3个传感器（15A、30A、45AT）响应值经过处理后的三维数据坐标位点。增加一个主成分后，PCA对样本点的聚类能力增加，同类样本点的间距缩小，不同类的间距也随之减小，不同类的样本点堆积在一起，难以区分。
考虑到以K值为响应信号，无法完全反映吸收光谱图信息，部分特征信息缺失后导致类别判别存在误差，因此，利用K值和吸收光谱组合进行主成分分析，以3个主成分PCA1、PCA2和PCA3组成三维空间，得到的结果如图6D所示，各点对应每个分析样品的3个传感元件（15A、30A、45AT DNA）的响应值（K值与吸收光谱）经过降维后的三维数据坐标位点。增加吸收光谱数据后，PCA对样本点的聚类效果更佳，同类样本点的间距缩小，可初步看到分类效果，但不同类样本点依然交叉存在，未能真正实现11种重金属鉴别区分。
综上，在应用二维和三维通道时，金属离子对应的响应K值不同，裸眼即可分辨出某些溶液颜色的差别，这主要是因为金属离子和DNA之间的相互作用不同导致了AuNPs的不同状态，进而导致吸收光谱不同，为金属离子鉴别的提供了可能。为了更明确地展现出11种金属离子对体系产生的各自特异性变化，分别将88个和132个数据以PCA进行处理，结果表明，即使增加一半的响应K值数据，分析鉴别的效果并没有明显的提升。当增加吸收光谱的数据时，吸收曲线提供了更加全面的信息，分析结果有所改善，但依然未完全区分开。因此，考虑PCA可能不适合于此类分析。
3.4.3LDA分析LDA是在输入变量上构造线性判别函数的特征选择方法，即寻找一种变换，使得在某种意义下类间分离性最大，类内相异性最小，是一种有监督的维数约简方法。LDA 充分利用了训练样本的类别信息，通过把原问题转化为关于样本集总类内散布矩阵和总类间散布矩阵的广义特征值问题进行求解[22]。以实验获得的132个响应K值进行LDA分析，结果如图7A所示，其聚类效果仍没有改进。因此，利用实验获得的132个响应K值及其对应吸收光谱组合进行LDA分析，结果如图 7B所示。由于LDA考虑到不同类间的差异，并将其扩大化，所以区分效果比主成分分析更优，11种重金属离子在空间区域内获得很好的离散，同类别的样本点几乎重合为一个点，不同类别的样本点之间完全
没有重叠，容易被区分开。同时，也说明所构建的比色传感器的对多种重金属离子的检测下限低于0.5 μmol/L。
4結 论
基于3条单链DNA对AuNPs的不同保护作用， 成功构建了一种无标记多维通道的阵列比色传感器， 用于多种重金属离子的鉴别。在高浓度盐的存在下，不同的金属离子可导致不同的DNA保护的AuNPs显示出不同的聚集行为，并呈现各种颜色变化。优化后的比色传感器最佳的NaCl浓度为120 mmol/L。 以此颜色变化作为传感器的响应信号，利用两种方法进行鉴别。PCA对11种重金属离子表现出有限区分能力; LDA可完全区分0.5 μmol/L的11种重金属离子（Ag+、Pb2+、Zn2+、Cu2+、Cd2+、Mn2+、Ni2+、Co2+、Hg2+、 Bi3+和Cr3+）。
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