一种利用数字全息成像测量粒子周长的方法
张文超+王圣旭+孙启利+谈世哲+曾贞
摘 要： 为了实现粒子周长的自动测量，提出一种利用数字全息成像测量粒子周长的方法。首先，介绍了数字全息成像的基本理论。接着，给出了实验装置的结构图，并对全息再现中的自动聚焦算法进行深入研究，提出一种改进的基于小波变换的自动聚焦算法。最后，在全息再现像图像分割的基础上给出粒子周长测量的具体方法。实验结果表明，测量的海洋浮游生物周长尺寸为17.918 mm，相对误差为3.51%。这种粒子周长测量方法基本满足粒子周长测量的稳定可靠、精度高、抗干扰能力强等要求，对其他粒子形态特征参数的测量研究也具有重要的借鉴意义。
关键词： 粒子周长测量； 数字全息； 自动聚焦； 图像分割
中图分类号： TN911.73?34； TP394.1 文献标识码： A 文章编号： 1004?373X（2017）13?0101?05
Abstract： In order to realize the automatic measurement of the particle circumference， a method of measuring particle circumference with digital holography imaging is proposed. The basic theory of digital holography imaging is introduced. The structure chart of the experimental device is given， and the autofocus algorithm for holography reconstruction is studied in depth. An improved autofocus algorithm based on wavelet transform is proposed. The specific method to measure the particle circumference is given on the basis of image segmentation of the holography reconstructed image. The experimental results show that the measured circumference of the marine plankton is 17.918 mm， and its relative error is 3.51%. The particle circumference measurement method can basically satisfy the requirements of the stability， high precision and strong anti?interference for particle circumference measurement， and has the important referential significance for the study on measurement of the other particle morphological characteristic parameters.
Keywords： particle circumference measurement； digital holography； autofocus； image segmentation
0 引 言
数字全息技术是指将全息图记录在电荷耦合器件CCD而非传统的干板上，并由计算机模拟光学衍射过程对全息图进行再现，从而以数字方式获取被测对象的三维图像[1]。在粒子场测量、变形测量、细胞研究与观测、信息加密等方面，数字全息技术以其独特的优势发挥着越来越重要的作用并取得了广泛应用。
全息成像可以分为全息记录和全息再现两个阶段，与传统的光学摄像不同，全息记录无需聚焦过程，只需将参考光与被测目标反射光的干涉条纹记录在CCD上，获取的信息中包含被测目标的三维空间分布，而全息再现阶段需要通过调整再现距离将CCD上记录的干涉条纹还原为被测目标的原始图像。再现距离不同，被测目标再现像的清晰度就不同，通过调整再现距离，得到一系列的再现像，根据聚焦判据函数可以判断出成像效果最好的再现像，以达到自动聚焦的目的。本文拟将数字全息技术应用到水下粒子观测中，获取到的全息再现像包含粒子场的各种原位信息，通过数字图像处理的方法完全可以提取粒子的周长，为更有效的进行水下粒子场观测和数据分析提供技术支撑。
1 数字全息成像基本理论
全息技术根据其光路结构可以分为同轴全息和离轴全息。同轴全息光路结构简单，较离轴全息更适合于在远距离操作或条件恶劣、要求苛刻的环境中使用。考虑到水下粒子观测的特点，本文拟采用同轴全息对水下粒子进行全息成像[2]。
全息技术是一个两步成像过程：第一步是全息图的波前记录；第二步是全息图的再现。如图1所示为数字全息记录和再现的坐标系统变换示意图。
图1中被记录的物体位于平面，记录全息图的CCD光敏面位于平面，再现像位于平面，CCD记录面与物平面和再现像平面的距离分别为。
1.1 波前记录
记录在CCD全息图上的干涉光场的光场强度分布为：
式中：*为复因子；，分别为投射到记录平面上物光波与参考波的复振幅分布，第一项为参考光的强度分布，第二项为物光波的强度分布，第三项和第四项为干涉项，对应于全息再现像中的实像和虚像。
设参考光采用振幅为的平面波，根据式（1），在菲涅耳近似衍射区，同轴全息光路记录的全息图可以表达为：
2 水下粒子周長测量
2.1 实验装置
水下粒子场全息记录装置结构示意图如图2所示，由该装置获取的桡足类海洋浮游生物全息图如图3所示。
2.2 全息再现自动聚焦算法的实现
实验中的程序利用Matlab编写，本文采用卷积再现算法实现海洋浮游生物的全息再现。卷积再现算法的流程图如图4所示。通过不断调整再现距离，可以得到一系列海洋浮游生物的全息再现像，直至从中选取出较为清晰的再现像。图5（a）和图5（b）分别为卷积再现算法获取的在焦再现像和离焦再现像。在实际的水下粒子场测量应用中，全息记录距离难以直接获取，全息再现时手动调整再现距离将给系统的自动化集成带来不便，故有必要对水下粒子场全息再现的自动聚焦算法进行研究[4?6]。
自动聚焦的实现关键在于选取合适的像质评价函数，享有“数学显微镜”美称的小波变换具有良好的局部时频特性，它可以捕捉到调焦过程中图像的细微特征变化，近年来在自动聚焦领域应用广泛[7?8]。正交小波变换具有能量不变的特性，图像越清晰，小波分解后的高频系数越大，低频系数越小。在聚焦过程中，随着图像的清晰，图像细节逐渐丰富，能量从低频段逐步向高频段转换，高频段能量逐渐增加，图像最清晰时，小波分解后的高频系数最大。
基于小波变换的像质评价函数为：
式中：为小波分解层数；和为第层各高频分量小波系数，相应的分解窗为和
数字全息再现像与普通成像不同，数字全息再现像采用相干光成像。当离焦成像时，不仅物体边缘细节变得模糊，同时还会生成一些衍射条纹，由于这些衍射条纹的出现，导致在焦和离焦再现像经小波变换后由像质评价函数获取的小波高频系数总和变化不大。将再现距离从80 mm等步长变化到130 mm，取步长为2 mm，这样每2 mm得到一幅再现像，共得到26幅再现像，将这26幅图像依次利用式（9）取即单层小波变换计算其图像清晰度，得到归一化的像质评价函数曲线图，如图6中的虚线所示。
由图6可见，像质评价函数曲线变化幅度小，且聚焦距离偏离了110 mm位置，因此式（9）不宜作为全息再现像的像质评价函数。将聚焦再现像与离焦再现像对比发现，尽管离焦再现像中存在衍射条纹，对小波变换高频系数之和产生了影响，但是目标图像的边缘却较聚焦再现像模糊得多，本文将再现像中相应分解窗中每一行像素的小波变换高频系数最大值进行求和作为全息再现像的像质评价函数：
取=1，即利用单层小波变换计算26幅再现像的清晰度，获得归一化的像质评价函数曲线图如图6中实线所示。相对于改进前的像质评价函数曲线，本文提出的全息再现像像质评价函数不仅聚焦位置准确，而且具有更好的无偏性和单峰性。
2.3 水下粒子周长的测量与提取
周长作为粒子形态特征的重要参数，实现其自动测量与提取对于粒子的数据分析与模式识别具有重要意义。本文利用数字图像处理技术对浮游生物全息再现像进行图像分割的基础上测量了粒子的周长，并设计实验对其相对误差进行研究。
2.3.1 海洋浮游生物全息再现像图像分割算法
本文提出的全息再现像图像分割算法分为三步：首先，对海洋浮游生物再现像进行基于阈值的目标分割，图5（a）的灰度直方图如图7所示，设计的自适应阈值选择程序将自动寻找两个最大波峰之间的谷底作为阈值并将图像上各像素与该阈值进行比较，按照下式对各像素赋值：
（1） 进行目标分割，分割后的图像如图8所示。
（2） 为精确定位海洋浮游生物的边缘轮廓，需要对图8进行边缘检测，本文采用基于Canny算子的边缘检测算法[9]，得到的海洋浮游生物边缘图像如图9所示。
（3） 对图9进行图像形态学闭运算处理，效果图如图10所示。
2.3.2 海洋浮游生物周长测量
海洋浮游生物全息再現像中浮游生物轮廓的长度即为周长。本文在提取浮游生物轮廓的基础上，通过链码计算轮廓的长度[10]。逐行扫描图10，若扫描到的像素及其8邻域的灰度值均为1，则将该像素灰度值置为0，重复执行该过程直至扫描完整幅图像，最后保留的白色像素即为浮游生物的轮廓线。接着利用链码计算周长，轮廓线可以看作由两两相邻的像素连接而成的线段沿逆时针方向顺次相连而成，每段线段的斜率有8种可能的方向：0°，45°，90°，135°，180°，225°，270°，315°，按次序分别对应数码0，1，2，3，4，5，6，7，记为链码，则。图11为链码定义的示意图，设每个像素的长度为则水平和垂直方向上即链码0，2，4，6方向上对应线段的长度为对角线方向上即链码1，3，5，7方向上对应线段的长度为。选取图像边缘的任一点作为起始点后，即可得到该图像边缘的链码串。最后由式（12）可得到轮廓周长：
为了消除图像中由于噪声而产生的轮廓，可通过先验知识粗略估计浮游生物的最小周长，并以此作为阈值，凡是轮廓长度低于此阈值的均被视作噪声。
2.4 实验结果与分析
实验直接获取的周长是以像素为单位，根据全息记录装置中CCD的参数，可将其换算为国际单位制，最终得到的数据如表1所示。
利用显微镜和相机，人工测量海洋浮游生物周长的实际尺寸，与全息测量值比较可得相对误差，如表2所示。
3 结 论
本文以海洋浮游生物为例，详细讨论了基于数字全息成像的粒子周长测量，对测量过程中遇到的关键问题进行了深入研究，主要包括数字全息再现算法、改进的基于小波变换的数字全息自动聚焦算法、全息再现像图像分割算法以及周长测量的具体实现算法。理论分析和实验结果表明，改进的基于小波变换的像质评价函数较传统的像质评价函数可更准确地实现全息再现像自动聚焦，这对于有效获取粒子形态特征参数具有重要作用。本文给出了海洋浮游生物周长测量的详细算法与实现步骤，测量的海洋浮游生物周长尺寸为17.918 mm，相对误差为3.51%。这种粒子周长测量方法基本满足粒子周长测量稳定可靠、精度高、抗干扰能力强等要求，对其他粒子形态特征参数的测量研究也具有重要的借鉴意义。
参考文献
[1] 吕且妮.数字全息技术及其在粒子场中的应用研究[D].天津：天津大学，2003.
[2] SUN H， BENZIE P W， BURNS N， et al. Underwater digital holography for studies of marine plankton [J]. Philosophical transactions： mathematical， physical and engineering sciences， 2008， 366（1871）： 1789?1806.
[3] TAN S Z， WANG S X. Digital holographic imaging of marine plankton [J]. Applied mechanics and materials， 2012， 198/199： 314?319.
[4] LIEBLING M， UNSER M. Autofocus for digital Fresnel holograms by use of a Fresnelet?sparsity criterion [J]. Journal of the optical society of america a： optics， image science， and vision， 2004， 21（12）： 2424?2430.
[5] 王华英，王广俊，王大勇，等.数字全息显微中的自动聚焦[J].光电子·激光，2010（8）：1232?1236.
[6] 徐元强，王玉荣，丁海生.数字同轴全息颗粒场检测中的颗粒分割识别与独立聚焦[J].光子学报，2010，39（3）：881?887.
[7] 王义文，刘献礼，谢晖.基于小波变换的显微图像清晰度评价函数及3?D自动调焦技术[J].光学精密工程，2006，14（6）：1063?1069.
[8] 吕恒毅，刘杨，薛旭成.基于微粒群区域搜索和小波评价的差分式自动聚焦[J].中国光学，2011，4（3）：283?292.
[9] CANNY J. A computational approach to edge detection [J]. IEEE transactions on pattern analysis and machine intelligence， 1986， 8（6）： 679?698.
[10] GONZALEZ R C， WOODS R E. Digital image processing [M]. New Jersey： Prentice Hall， 2007： 519?634.
摘 要： 为了实现粒子周长的自动测量，提出一种利用数字全息成像测量粒子周长的方法。首先，介绍了数字全息成像的基本理论。接着，给出了实验装置的结构图，并对全息再现中的自动聚焦算法进行深入研究，提出一种改进的基于小波变换的自动聚焦算法。最后，在全息再现像图像分割的基础上给出粒子周长测量的具体方法。实验结果表明，测量的海洋浮游生物周长尺寸为17.918 mm，相对误差为3.51%。这种粒子周长测量方法基本满足粒子周长测量的稳定可靠、精度高、抗干扰能力强等要求，对其他粒子形态特征参数的测量研究也具有重要的借鉴意义。
关键词： 粒子周长测量； 数字全息； 自动聚焦； 图像分割
中图分类号： TN911.73?34； TP394.1 文献标识码： A 文章编号： 1004?373X（2017）13?0101?05
Abstract： In order to realize the automatic measurement of the particle circumference， a method of measuring particle circumference with digital holography imaging is proposed. The basic theory of digital holography imaging is introduced. The structure chart of the experimental device is given， and the autofocus algorithm for holography reconstruction is studied in depth. An improved autofocus algorithm based on wavelet transform is proposed. The specific method to measure the particle circumference is given on the basis of image segmentation of the holography reconstructed image. The experimental results show that the measured circumference of the marine plankton is 17.918 mm， and its relative error is 3.51%. The particle circumference measurement method can basically satisfy the requirements of the stability， high precision and strong anti?interference for particle circumference measurement， and has the important referential significance for the study on measurement of the other particle morphological characteristic parameters.
Keywords： particle circumference measurement； digital holography； autofocus； image segmentation
0 引 言
数字全息技术是指将全息图记录在电荷耦合器件CCD而非传统的干板上，并由计算机模拟光学衍射过程对全息图进行再现，从而以数字方式获取被测对象的三维图像[1]。在粒子场测量、变形测量、细胞研究与观测、信息加密等方面，数字全息技术以其独特的优势发挥着越来越重要的作用并取得了广泛应用。
全息成像可以分为全息记录和全息再现两个阶段，与传统的光学摄像不同，全息记录无需聚焦过程，只需将参考光与被测目标反射光的干涉条纹记录在CCD上，获取的信息中包含被测目标的三维空间分布，而全息再现阶段需要通过调整再现距离将CCD上记录的干涉条纹还原为被测目标的原始图像。再现距离不同，被测目标再现像的清晰度就不同，通过调整再现距离，得到一系列的再现像，根据聚焦判据函数可以判断出成像效果最好的再现像，以达到自动聚焦的目的。本文拟将数字全息技术应用到水下粒子观测中，获取到的全息再现像包含粒子场的各种原位信息，通过数字图像处理的方法完全可以提取粒子的周长，为更有效的进行水下粒子场观测和数据分析提供技术支撑。
1 数字全息成像基本理论
全息技术根据其光路结构可以分为同轴全息和离轴全息。同轴全息光路结构简单，较离轴全息更适合于在远距离操作或条件恶劣、要求苛刻的环境中使用。考虑到水下粒子观测的特点，本文拟采用同轴全息对水下粒子进行全息成像[2]。
全息技术是一个两步成像过程：第一步是全息图的波前记录；第二步是全息图的再现。如图1所示为数字全息记录和再现的坐标系统变换示意图。
图1中被记录的物体位于平面，记录全息图的CCD光敏面位于平面，再现像位于平面，CCD记录面与物平面和再现像平面的距离分别为。
1.1 波前记录
记录在CCD全息图上的干涉光场的光场强度分布为：
式中：*为复因子；，分别为投射到记录平面上物光波与参考波的复振幅分布，第一项为参考光的强度分布，第二项为物光波的强度分布，第三项和第四项为干涉项，对应于全息再现像中的实像和虚像。
设参考光采用振幅为的平面波，根据式（1），在菲涅耳近似衍射区，同轴全息光路记录的全息图可以表达为：
2 水下粒子周長测量
2.1 实验装置
水下粒子场全息记录装置结构示意图如图2所示，由该装置获取的桡足类海洋浮游生物全息图如图3所示。
2.2 全息再现自动聚焦算法的实现
实验中的程序利用Matlab编写，本文采用卷积再现算法实现海洋浮游生物的全息再现。卷积再现算法的流程图如图4所示。通过不断调整再现距离，可以得到一系列海洋浮游生物的全息再现像，直至从中选取出较为清晰的再现像。图5（a）和图5（b）分别为卷积再现算法获取的在焦再现像和离焦再现像。在实际的水下粒子场测量应用中，全息记录距离难以直接获取，全息再现时手动调整再现距离将给系统的自动化集成带来不便，故有必要对水下粒子场全息再现的自动聚焦算法进行研究[4?6]。
自动聚焦的实现关键在于选取合适的像质评价函数，享有“数学显微镜”美称的小波变换具有良好的局部时频特性，它可以捕捉到调焦过程中图像的细微特征变化，近年来在自动聚焦领域应用广泛[7?8]。正交小波变换具有能量不变的特性，图像越清晰，小波分解后的高频系数越大，低频系数越小。在聚焦过程中，随着图像的清晰，图像细节逐渐丰富，能量从低频段逐步向高频段转换，高频段能量逐渐增加，图像最清晰时，小波分解后的高频系数最大。
基于小波变换的像质评价函数为：
式中：为小波分解层数；和为第层各高频分量小波系数，相应的分解窗为和
数字全息再现像与普通成像不同，数字全息再现像采用相干光成像。当离焦成像时，不仅物体边缘细节变得模糊，同时还会生成一些衍射条纹，由于这些衍射条纹的出现，导致在焦和离焦再现像经小波变换后由像质评价函数获取的小波高频系数总和变化不大。将再现距离从80 mm等步长变化到130 mm，取步长为2 mm，这样每2 mm得到一幅再现像，共得到26幅再现像，将这26幅图像依次利用式（9）取即单层小波变换计算其图像清晰度，得到归一化的像质评价函数曲线图，如图6中的虚线所示。
由图6可见，像质评价函数曲线变化幅度小，且聚焦距离偏离了110 mm位置，因此式（9）不宜作为全息再现像的像质评价函数。将聚焦再现像与离焦再现像对比发现，尽管离焦再现像中存在衍射条纹，对小波变换高频系数之和产生了影响，但是目标图像的边缘却较聚焦再现像模糊得多，本文将再现像中相应分解窗中每一行像素的小波变换高频系数最大值进行求和作为全息再现像的像质评价函数：
取=1，即利用单层小波变换计算26幅再现像的清晰度，获得归一化的像质评价函数曲线图如图6中实线所示。相对于改进前的像质评价函数曲线，本文提出的全息再现像像质评价函数不仅聚焦位置准确，而且具有更好的无偏性和单峰性。
2.3 水下粒子周长的测量与提取
周长作为粒子形态特征的重要参数，实现其自动测量与提取对于粒子的数据分析与模式识别具有重要意义。本文利用数字图像处理技术对浮游生物全息再现像进行图像分割的基础上测量了粒子的周长，并设计实验对其相对误差进行研究。
2.3.1 海洋浮游生物全息再现像图像分割算法
本文提出的全息再现像图像分割算法分为三步：首先，对海洋浮游生物再现像进行基于阈值的目标分割，图5（a）的灰度直方图如图7所示，设计的自适应阈值选择程序将自动寻找两个最大波峰之间的谷底作为阈值并将图像上各像素与该阈值进行比较，按照下式对各像素赋值：
（1） 进行目标分割，分割后的图像如图8所示。
（2） 为精确定位海洋浮游生物的边缘轮廓，需要对图8进行边缘检测，本文采用基于Canny算子的边缘检测算法[9]，得到的海洋浮游生物边缘图像如图9所示。
（3） 对图9进行图像形态学闭运算处理，效果图如图10所示。
2.3.2 海洋浮游生物周长测量
海洋浮游生物全息再現像中浮游生物轮廓的长度即为周长。本文在提取浮游生物轮廓的基础上，通过链码计算轮廓的长度[10]。逐行扫描图10，若扫描到的像素及其8邻域的灰度值均为1，则将该像素灰度值置为0，重复执行该过程直至扫描完整幅图像，最后保留的白色像素即为浮游生物的轮廓线。接着利用链码计算周长，轮廓线可以看作由两两相邻的像素连接而成的线段沿逆时针方向顺次相连而成，每段线段的斜率有8种可能的方向：0°，45°，90°，135°，180°，225°，270°，315°，按次序分别对应数码0，1，2，3，4，5，6，7，记为链码，则。图11为链码定义的示意图，设每个像素的长度为则水平和垂直方向上即链码0，2，4，6方向上对应线段的长度为对角线方向上即链码1，3，5，7方向上对应线段的长度为。选取图像边缘的任一点作为起始点后，即可得到该图像边缘的链码串。最后由式（12）可得到轮廓周长：
为了消除图像中由于噪声而产生的轮廓，可通过先验知识粗略估计浮游生物的最小周长，并以此作为阈值，凡是轮廓长度低于此阈值的均被视作噪声。
2.4 实验结果与分析
实验直接获取的周长是以像素为单位，根据全息记录装置中CCD的参数，可将其换算为国际单位制，最终得到的数据如表1所示。
利用显微镜和相机，人工测量海洋浮游生物周长的实际尺寸，与全息测量值比较可得相对误差，如表2所示。
3 结 论
本文以海洋浮游生物为例，详细讨论了基于数字全息成像的粒子周长测量，对测量过程中遇到的关键问题进行了深入研究，主要包括数字全息再现算法、改进的基于小波变换的数字全息自动聚焦算法、全息再现像图像分割算法以及周长测量的具体实现算法。理论分析和实验结果表明，改进的基于小波变换的像质评价函数较传统的像质评价函数可更准确地实现全息再现像自动聚焦，这对于有效获取粒子形态特征参数具有重要作用。本文给出了海洋浮游生物周长测量的详细算法与实现步骤，测量的海洋浮游生物周长尺寸为17.918 mm，相对误差为3.51%。这种粒子周长测量方法基本满足粒子周长测量稳定可靠、精度高、抗干扰能力强等要求，对其他粒子形态特征参数的测量研究也具有重要的借鉴意义。
参考文献
[1] 吕且妮.数字全息技术及其在粒子场中的应用研究[D].天津：天津大学，2003.
[2] SUN H， BENZIE P W， BURNS N， et al. Underwater digital holography for studies of marine plankton [J]. Philosophical transactions： mathematical， physical and engineering sciences， 2008， 366（1871）： 1789?1806.
[3] TAN S Z， WANG S X. Digital holographic imaging of marine plankton [J]. Applied mechanics and materials， 2012， 198/199： 314?319.
[4] LIEBLING M， UNSER M. Autofocus for digital Fresnel holograms by use of a Fresnelet?sparsity criterion [J]. Journal of the optical society of america a： optics， image science， and vision， 2004， 21（12）： 2424?2430.
[5] 王华英，王广俊，王大勇，等.数字全息显微中的自动聚焦[J].光电子·激光，2010（8）：1232?1236.
[6] 徐元强，王玉荣，丁海生.数字同轴全息颗粒场检测中的颗粒分割识别与独立聚焦[J].光子学报，2010，39（3）：881?887.
[7] 王义文，刘献礼，谢晖.基于小波变换的显微图像清晰度评价函数及3?D自动调焦技术[J].光学精密工程，2006，14（6）：1063?1069.
[8] 吕恒毅，刘杨，薛旭成.基于微粒群区域搜索和小波评价的差分式自动聚焦[J].中国光学，2011，4（3）：283?292.
[9] CANNY J. A computational approach to edge detection [J]. IEEE transactions on pattern analysis and machine intelligence， 1986， 8（6）： 679?698.
[10] GONZALEZ R C， WOODS R E. Digital image processing [M]. New Jersey： Prentice Hall， 2007： 519?634.
