不同静压力下脂多糖刺激牙周膜成纤维细胞对炎症相关因子表达的影响

    覃雅庆 沈慧娟 农冬梅 周华 康娜

    [摘要]目的：探討牙周炎中牙龈卟啉单胞菌LPS（Porphyromonas gingivalis Lipopolysaccharide，Pg.LPS）和人牙周膜成纤维细胞（human periodontal ligament fibroblast， HPDLF）与正畸炎症相关的牙根吸收作用机制。方法：取4～6代体外培养的HPDLF，MTT法检测1～10μg/ml Pg.LPS对HPDLF增殖活性的影响，再选择最佳浓度作用于HPDLF，加载0～5g/cm2静压力24h，实验组分为静压力组和Pg.LPS+静压力组，通过qRT-PCR和ELISA检测HPDLF白细胞介素17（interleukin 17，IL-17）及白细胞介素6（interleukin 6，IL-6）的mRNA和蛋白表达水平。结果：①HPDLF增殖在1～4μg/ml Pg.LPS刺激时随浓度增加而增加，在5～7μg/ml随浓度增加而减少，8～10μg/ml细胞增殖明显受到抑制;②两组中IL-17、IL-6的表达量随静压力值增加而增强，相同力值下对照组的IL-17、IL-6表达量高于实验组，差异有统计学意义。结论：Pg.LPS浓度过高能抑制HPDLF增殖，而适当的浓度则促进其增殖;Pg.LPS和静压力均能刺激HPDLF产生炎症相关因子，参与正畸炎症相关牙根吸收发生发展的过程。

    [关键词]人牙周膜成纤维细胞;白细胞介素17;白细胞介素6;牙龈卟啉单胞菌;脂多糖;静压力

    [中图分类号]R782.2 ? ?[文献标志码]A ? ?[文章编号]1008-6455（2020）01-0079-05

    Effects of Lipopolysaccharides on the Expression of Proinflammatory Factors in Periodontal Fibroblasts Stimulated by Lipopolysaccharides under

    Different Static Pressure

    QIN Ya-qing，SHEN Hui-jun，NONG Dong-mei，ZHOU Hua，KANG Na

    （Department of Orthodontics， Affiliated Stomatological Hospital of Guangxi Medical University Guangxi Key Laboratory of Oral and Maxillofacial Rehabilitation and Reconstruction ?Guangxi Clinical Research Center for Craniofacial Deformity ?Guangxi Key Laboratory of Oral and Maxillofacial Surgery Disease Treatment，

    Nanning 530021，Guangxi，China）

    Abstract： Objective To investigate the mechanism of Porphyromonas gingivalis Lipopolysaccharide （Pg.LPS） and human periodontal fibroblast （HPDLF） in orthodontic inflammatory-related root resorption in periodontitis. Methods ?The HPDLF cultured in vitro for 4-6 generations was used to detect the effect of 1-10 μg/ml Pg.LPS on the proliferation of HPDLF by MTT assay. Then choose the optimal concentration stimulate HPDLF and load 0-5 g/cm2 static pressure strength for 24 hours. The experimental group was divided into static pressure group and Pg. LPS + static pressure group. QRT-PCR and enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA） were used to detect the mRNA and protein expression levels of interleukin-17 and interleukin-6 in HPDLF. Results ①HPDLF proliferation increased with the increase of concentration in 1-4 μg/ml Pg.LPS stimulation， decreased with the increase of concentration in 5-7 μg/ml， and was significantly inhibited cell proliferation in 8-10 μg/ml.② The expressions of interleukin 17 and interleukin 6 in the static pressure group and Pg.LPS + static pressure group increased with the increase of static pressure value， and the expressions of interleukin 17 and interleukin 6 in the static pressure group were higher than those in Pg.LPS + static pressure group under the same force value， and the difference was statistically significant. Conclusion ?Excessive concentration of Pg. LPS inhibited the proliferation of HPDLF， and the appropriate concentration could promote the proliferation of HPDLF. Both Pg. LPS and static pressure can stimulate HPDLF to produce pro-inflammatory factors and participate in the development of orthodontic inflammatory-related root resorption， but Pg. LPS inhibits the secretion of pro-inflammatory factors by static pressure on HPDLF.

    Key words： human periodontal ligament fibroblast; interleukin 17; interleukin 6; porphyromonas gingivalis; lipopolysaccharide; static pressure

    牙齦卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis，Pg）是引起慢性牙周炎的主要病原体，而LPS（Lipopolysaccharide，LPS）是其细胞壁外层的重要组成部分，可诱导炎症相关细胞因子如IL-6的表达以及参与牙周组织的破坏[1]。IL-6被认为是经典的骨吸收促炎细胞因子，它不仅可以通过接触破骨前体细胞刺激破骨细胞的形成，还可以通过上调成骨细胞谱系表达核因子κB受体活化因子配体（receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL）来刺激破骨细胞的形成[2]。IL-17是一种主要由活化的辅助性T细胞17（TH17）产生的致炎细胞因子，也是参与破骨细胞产生的主要分子之一，可增强牙周膜成纤维细胞RANKL的表达以破坏骨组织。它还通过诱导牙周炎患者的成纤维细胞中基质金属蛋白酶的表达，介导牙周组织的破坏，相较于牙周健康者而言牙周炎患者可检测到更高水平的IL-17[3-6]。

    人牙周膜成纤维细胞作为牙周膜的重要功能细胞，调节牙周组织稳态，形成胶原结构蛋白，发挥天然免疫防御的调节功能，对正畸牙移动（orthodontic tooth movement，OTM）也起到了重要的中介作用[7]。在对牙齿施加正畸力后，HPDLF受到压缩或拉伸的机械应力，通过机械转导使细胞因子和趋化因子的合成增加，特别是前列腺素和白三烯由于诱导的环氧合酶2（COX2）的活性增加而释放，其对HPDLF和成骨细胞具有自分泌和旁分泌作用，增加可溶性和膜连接的RANKL以及炎症相关细胞因子如IL-1、IL-6的表达，这些因子又反过来继续增强RANKL的表达和加快基质金属蛋白酶的释放，影响细胞外基质的降解，从而诱导OTM[8]。

    本课题组前期实验证明，在静压力下IL-17在HPDLF中主要通过两条途径诱导RANKL产生从而导致破骨细胞的分化及成熟：一是HPDLF在静压力下生成IL-17及其他炎症相关因子和IL-17R相连接，直接作用使HPDLF调节IL-6、RANKL和其他因子;二是IL-17与IL-17R相连接，刺激HPDLF大量产生IL-6，通过IL-6这条旁路进一步调节RANKL等炎症相关因子的表达。往期研究并未完全阐明牙周炎中IL-17的作用机制，LPS对HPDLF的作用尚未完全清楚。在正畸力下，促炎细胞因子与牙周组织骨改建之间的关系更是鲜有报道。本实验建立体外模拟正畸压力模型，用LPS模拟牙周炎症环境，检测不同静压力下HPDLF中IL-6、IL-17的表达水平，探索各因子间的相互作用关系，为临床上牙周炎患者在正畸治疗过程中预防牙根吸收和牙槽骨退缩提供新思路。

    1 ?材料和方法

    1.1 实验对象：本实验所需组织取自笔者医院颌面外科门诊11～16岁患者因正畸需要而拔除的20颗健康前磨牙（无牙体牙髓、牙周疾病），均取得患者知情同意，并通过了伦理委员会同意。

    1.2 实验材料：维森特胎牛血清（澳洲血源）、DMEM培养基，Pg.LPS（Invivogen公司），MTT溶液（vazyme公司），DMSO溶液（Sigma公司），逆转录试剂盒、IL-6、IL-17、TNF-α、GAPDH上下游引物（TaKaRa公司），IL-6、IL-17 ELISAkit（武汉华美生物工程有限公司）等。

    1.3 实验方法

    1.3.1 HPDLF的培养：用无菌刀片刮下根中1/3的牙周膜组织，采用组织块培养法原代培养细胞，待HPDLF从组织块爬出并覆盖瓶底80%时传代培养。取4～6代HPDLF用做后续实验。

    1.3.2 Pg.LPS刺激下对HPDLF增殖活性的影响：将4～6代HPDLF制成单细胞悬液接种于96孔板，滴加配成10% FBS的DMEM培养液，实验组分10组，LPS浓度按1～10 μg/ml逐渐递增，设置空白孔（无细胞）和对照孔（无LPS，有细胞），置于37℃、5% CO2的培养箱孵育24h。采用MTT比色法检测吸光值，观察不同浓度的LPS对HPDLF的细胞增殖活性的影响，选取最适宜浓度进行下一步实验。

    1.3.3 不同静压力下Pg.LPS刺激HPDLF：取4～6代HPDLF制成细胞悬液，以2ml/皿均匀接种，在CO2温箱中孵育。次日换液，每孔加入2ml配成10% FBS的DMEM培养液继续孵育。2～3d后待HPDLF铺满皿底行Pg.LPS刺激与加力处理。用PBS液冲洗2次，每孔滴加1ml配成1% FBS的DMEM培养液沉淀1h，加入4μg/ml Pg.LPS，使用加力附件与圆形盖玻片放于单层HPDLF上，这时细胞的受力分别为0、1、2、3、4、5g/cm2，然后再置入CO2孵箱中孵育24h。

    1.3.4 实验检测：收集干预后的HPDLF，提取总RNA，将其作为模版逆转录为cDNA，用SYBRGreenI染料法进行qRT-PCR，检测不同静压力作用下，IL-6、IL-17在HPDLF中的mRNA表达水平。同时收集上清液，ELISA检测不同压力作用下，LPS刺激HPDLF分泌的IL-6、IL-17的蛋白表达水平。

    1.4 统计学分析：实验结果用x?±s表示，运用SPSS 17.0软件统计，两组比较采用配对t检验，三组间比较采用单因素方差分析，α=0.05，P<0.05为差异有统计学意义。

    2 ?结果

    2.1 Pg.LPS刺激下对HPDLF增殖活性的影响：Pg.LPS刺激24h后，MTT结果示1～4μg/ml时OD值持续升高，HPDLF的增殖能力较对照组增强，4μg/ml到达高峰，差异具有统计学意义（P<0.01），5～7μg/ml中HPDLF细胞活力逐渐下降，随着浓度的进一步增大，HPDLF细胞活力受到抑制，8～10μg/ml组中HPDLF细胞活力明显被抑制，差异有统计学意义（P<0.01）。MTT检测结果可得出，适宜浓度的Pg.LPS对HPDLF增殖活性有促进作用，但浓度过高则抑制其活性。

    2.2 不同靜压力下Pg.LPS刺激HPDLF IL-6和IL-17 mRNA的表达水平：qRT-PCR检测IL-6、IL-17 mRNA的表达水平显示，静压力组中，1～5g/cm2组的IL-6、IL-17的mRNA表达水平相较于空白对照组显著升高（P<0.01），IL-6、IL-17的mRNA表达量随力的大小增加而增加，4g/cm2达到最大，随后开始下降。而经4μg/ml Pg.LPS刺激HPDLF 24h后，在Pg.LPS+静压力组内，1～5g/cm2组中的IL-6、IL-17的mRNA表达水平相较于Pg.LPS未加力对照组显著升高（P<0.01），IL-6、IL-17的mRNA表达量随力的大小增加而增加，3g/cm2达到最大，随后开始下降。在相同力值下，Pg.LPS+静压力组中IL-6、IL-17 mRNA表达水平与静压力组相比较显著降低（P<0.05）（见表2～3、图2～3）。

    2.3 不同静压力下Pg.LPS刺激HPDLF时IL-6和IL-17蛋白的表达水平：通过ELISA检测IL-6和IL-17的蛋白表达水平，静压力组中，1～5g/cm2组的IL-6和IL-17的蛋白表达水平相较于空白对照组显著升高（P<0.01），IL-6和IL-17的蛋白表达量随力的大小增加而增加，4g/cm2达到最大，随后开始下降。而经4μg/ml Pg.LPS刺激HPDLF 24h后，在Pg.LPS+静压力组内，1～5g/cm2组中IL-6和IL-17的蛋白表达水平相较于Pg.LPS未加力对照组显著升高（P<0.01），IL-6和IL-17的蛋白表达量随力的大小增加而增加，3g/cm2达到最大，随后开始下降。

    在相同力值下，Pg.LPS+静压力组相对于静压力组的IL-6蛋白表达水平降低，4g/cm2组中的差异具有显著性;而IL-17的蛋白表达水平降低，在0～5g/cm2组的差异均具有显著性（P<0.05）（见表4～5、图4～5）。

    3 ? 讨论

    正畸治疗对牙齿应用机械力使牙周膜和牙槽骨重塑，从而转变为OTM，机械力被转换为负责基因转录物变化的生物信号，这些信号对细胞外基质的调节有不同的影响[9]。有研究证实，在机械力诱导下牙周组织及炎性细胞通过Wnt/β-catenin pathway、MAPKs pathway等多种传导途径来释放IL-6、IL-1β、TNF-α等炎症相关因子诱导成骨细胞表达RANKL，在巨噬细胞集落刺激因子（macrophage colony stimulating factor，M -CSF）存在的前提下与核因子κB受体活化因子（receptor activator of nuclear factor-κB，RANK）结合，启动胞内信号转导，上调RANKL及下调骨保护素（osteoprotegerin，OPG）来促进破骨细胞的分化和成熟，形成骨吸收[7-8，10]。

    对于不同浓度LPS对HPDLF的增殖活性影响测定，本实验采用了MTT比色法，结果提示：LPS可影响HPDLF的增殖活性，低浓度时其增殖加快，若作用时间长时则会表现毒性作用，抑制其生长;高浓度LPS对细胞有毒性作用，可抑制增殖，且刺激时间越久抑制率越高。低浓度LPS可促进HPDLF的增殖。一是直接作用，可能因LPS影响细胞内外Ca2+的跨膜转运[11]，也可能是由于LPS激活了细胞内ephrin/Eph等信号通路而促进了细胞内的基因表达[12];二是间接作用，LPS通过刺激细胞产生生物活性因子而刺激细胞增殖。但随作用时间的增加，细胞耐受性下降，细胞过度成熟，产能减少，胞内基质金属蛋白酶等多种酶分泌增加，导致细胞裂解，然后表现为细胞的毒性作用[13]。高浓度LPS抑制细胞增殖可能与细胞释放的CTOkins或介质有关[14]。

    先前实验中静压力作用下HPDLF能产生IL-17及其余炎症相关因子，本实验静压力组证明其最佳力值为4g/cm2，此时各炎症相关因子最易分泌。Pg.LPS+静压力组与对照组或空白组分泌量相比差异均有显著性。然而相同力值下与静压力组比较，各炎症相关因子分泌水平均降低，和之前实验结果不同：患有牙周炎的大鼠注射LPS后，IL-17、IL-6等分泌水平高于正畸加力组[15-16]。分析该结果的可能原因是：一是由于该实验不同于先前细胞实验中的LPS浓度，低浓度下未引起炎症反应，因此，低浓度LPS可能抑制HPDLF的炎症相关因子分泌;二是作用时间不够，LPS尚未发挥作用。值得注意的是，在Pg.LPS+静压力组中，最适静压力值降低，说明在Pg.LPS作用下HPDLF能承受的力值有所降低，这类似于临床上对牙周炎患者的正畸治疗中进行轻度和持续的正畸治疗的需要。

    本实验探究了Pg.LPS与静压力联合作用于HPDLF产生的IL-17、IL-6的表达水平和影响，这从一种独创性角度来了解骨改建和骨吸收的机理和机制。然而，由于该实验未在不同时间点设置实验对照，未从时间方面来考虑，所以该实验设置24h或许并非Pg.LPS刺激HPDLF最适时间，后期实验中应调整以不同浓度LPS作用不同时间点，以期得到更全面的结果，IL-17和其他炎症相关因子的机理和机制研究仍需进一步探索。

    [参考文献]

    [1]Hayata M，Watanabe N，Kamio N，et al.Cynaropicrin from Cynara scolymus L.suppresses Porphyromonas gingivalis LPS-induced production of inflammatory cytokines in human gingival fibroblasts and RANKL-induced osteoclast differentiation in RAW264.7 cells[J].J Nat Med，2019，73（1）：114-123.

    [2]Wu Q，Zhou X，Huang D，et al.IL-6 enhances osteocyte-mediated osteoclastogenesis by promoting jak2 and rankl activity in vitro[J].Cell Physiol Biochem，2017，41（4）：1360-1369.

    [3]Wang ZX，Yang L，Tan JY，et al.Effects of T helper 1 cells and T helper 17 cells secreting cytokines on rat models of experimental periodontitis[J].Zhonghua Kou Qiang Yi Xue Za Zhi，2017，52（12）：740-747.

    [4]Chen XT，Tan JY，Lei LH，et al.Cytokine levels in plasma and gingival crevicular fluid in chronic periodontitis[J].Am J Dent，2015，28（1）：9-12.

    [5]Kim HR，Kim KW，Kim BM，et al.N-acetyl-l-cysteine controls osteoclastogenesis through regulating Th17 differentiation and RANKL in rheumatoid arthritis[J].Korean J Intern Med，2019，34（1）：210-219.

    [6]黄莹，马哲.IL-17与牙周炎和冠心病相关性综述[J].现代口腔医学杂志，2018，32（4）：237-241.

    [7]Schroder A，Bauer K，Spanier G，et al.Expression kinetics of human periodontal ligament fibroblasts in the early phases of orthodontic tooth movement[J].J Orofac Orthop，2018，79（5）：337-351.

    [8]Meikle MC.The tissue，cellular，and molecular regulation of orthodontic tooth movement：100 years after Carl Sandstedt[J].Eur J Orthod，2006， 28（3）：221-240.

    [9]Fleissig O，Reichenberg E，Tal M，et al.Morphologic and gene expression analysis of periodontal ligament fibroblasts subjected to pressure[J].Am J Orthod Dentofacial Orthop，2018，154（5）：664-676.

    [10]Padisar P，Hashemi R，Naseh M，et al.Assessment of tumor necrosis factor alpha （TNFalpha） and interleukin 6 level in gingival crevicular fluid during orthodontic tooth movement：a randomized split-mouth clinical trial[J]. Electron Physician，2018，10（8）：7146-7154.

    [11]Azenabor AA，Kennedy P，York J.Free intracellular Ca2+ regulates bacterial lipopolysaccharide induction of iNOS in human macrophages[J].Immunobiology， 2009，214（2）：143-152.

    [12]Li M，Zhang C，Jin L，et al.Porphyromonas gingivalis lipopolysaccharide regulates ephrin/Eph signalling in human periodontal ligament fibroblasts[J].J Periodontal Res，2017，52（5）：913-921.

    [13]Zhou J，Windsor LJ.Heterogeneity in the collagen-degrading ability of Porphyromonas gingivalis-stimulated human gingival fibroblasts[J].J Periodontal Res，2007，42（1）：77-84.

    [14]Lertchirakarn V，Aguilar P.Effects of lipopolysaccharide on the proliferation and osteogenic differentiation of stem cells from the apical papilla[J].J Endod，2017，43（11）：1835-1840.

    [15]陳莉，李小彤，范晓川，等.正畸力诱导下白介素17在大鼠不同状态牙周组织中的表达[J].中华口腔医学杂志，2015，50（10）：619-623.

    [16]米丛波，潘旭，钱雅婧，等.正畸力作用下炎性牙周组织中白介素-8的表达[J].中国美容医学，2011，20（7）：1134-1138.

    [收稿日期]2019-03-28

    本文引用格式：覃雅庆，沈慧娟，农冬梅，等.不同静压力下脂多糖刺激牙周膜成纤维细胞对炎症相关因子表达的影响[J].中国美容医学，2020，29（1）：79-83.