响应面法优选黄芩苷水提工艺

    翟阳 赵渤年

    摘 ? ? ?要：為了优选黄芩药材中黄芩苷的最佳水提工艺，在单因素实验的基础上，采用了响应面分析法，以黄芩苷含量为评价指标，优选黄芩药材中黄芩苷的水提工艺参数。结果最佳水提工艺参数为提取时间2.25 h，料液比57 mL/g，提取次数2次。优选的工艺合理可行，提取效率高，可作为黄芩中黄芩苷的水提工艺，更适合于临床实际需求。

    关 ?键 ?词：黄芩苷;响应面法;水提工艺;含量测定

    中图分类号：R284.2 ? ? ? 文献标识码： A ? ? ?文章编号： 1671-0460（2020）02-0349-04

    Abstract： To optimize the extraction process of baicalin from scutellariabaicalensis， on the basis of single factor experiment， the response surface analysis was used to optimize the extraction parameters of baicalin from scutellariabaicalensis with the baicalin content as the evaluation index. The optimum water extraction process parameters were determined as follows： the extraction time 2.25 h， material-to-liquid ratio 57 mL/g， and extraction times 2 times. The optimized process is reasonable and feasible. It can be used for the water extraction process of baicalin from scutellariabaicalensis and it is more suitable for clinical practice.

    Key words： Baicalin; Response surface method; Water extraction technology; Content determination

    中药黄芩最早记载于《神农本草经》，属于唇形科植物，呈性寒，味苦，有清热、泻火、止血之功效，黄酮类和多糖类以及挥发油等是黄芩的主要化学成分[1]，其中黄芩苷为黄芩主要有效成分，药理作用广泛，主要包括抑菌作用、抗肿瘤作用、抗动脉粥样硬化、抗氧化作用、抗炎作用、抗病毒作用等[2-7]。

    目前黄芩苷提取工艺主要有电磁裂解提取、超声提取、微波提取、乙醇回流提取等方式，但相比而言水提法成本低、安全性高，普遍性广、实用性好，且与传统中医用药方法相契合[8-10]。

    提取工艺的参数优化通过响应面法和正交设计法均可实现，但是响应面法能够以图形的形式将自变量与因变量之间的函数关系表现出来，具有数据直观明确、更易于发现最佳工艺、成本较低等优点，因此本实验采取响应面法优化黄芩药材中黄芩苷的水提工艺[11]。

    1 ?实验部分

    1.1 ?仪器

    FW-80高速万能粉碎机（北京市光明医疗仪器有限公司）;Waters e2695高效液相色谱仪（美国Waters公司）;BP211D型电子天平（赛多利斯科学仪器（北京）有限公司）;VS-1300-U 型洁净工作台（苏州安泰工空技术有限公司）;Molgene 1820D摩尔基因型纯水机（上海摩勒科学仪器有限公司公司）;德国默克密理博Milli-Q IQ 7000超纯水系统（南京科麟得科学仪器有限公司）;Venusil MP C18（4.6 mm × 250 mm，5μm）;KDM-A控温电热套（金坛市医疗仪器厂）。

    1.2 ?试剂

    磷酸（天津市科密欧化学试剂有限公司，色谱纯）;甲醇（上海星可高纯溶剂有限公司，色谱纯）;高效液相色谱用水为超纯水。

    1.3 ?试药

    黄芩药材购自同仁堂（批号：20180712，产地：内蒙，经山东省中医药研究院林慧彬研究院鉴定为唇形科植物黄芩ScutellariabaicalensisGeorgi的干燥根），经含量测定质量合格[12];黄芩苷（批号：110715-200815，中国药品生物制品鉴定所）。

    2 ?方法与结果

    2.1 ?黄芩苷的含量测定

    2.1.1 ?色谱条件

    色谱柱：Venusil MP C18（4.6 mm × 250 mm，5μm）;以甲醇-水-磷酸（47∶53∶0.2）为流动相;检测波长为280 nm，柱温30 ℃，流速1.0 mL/min，进样量10 ?L。理论塔板按黄芩苷峰计算应不低于2 500[12]。

    2.1.2 ?样品溶液的制备

    （1）对照品溶液的制备 ?精密称取黄芩苷对照品0.6 mg，用甲醇定容于10 mL容量瓶中。

    （2）供试品溶液的制备 ?取干燥黄芩药材，粉碎至中粉，精密称定0.5 g，按照试验条件加入一定比例的水，回流提取，放冷，滤过，滤液置于100 mL容量瓶中，用少量水粉刺洗涤容器和残渣，洗液滤入同一量瓶中，用水定容至刻度，摇匀。精密量取1 mL，置于10 mL容量瓶中，加水至刻度，摇匀，即得。

    2.1.3 ?线性关系考察

    精密吸取2、4、6、8、10、20 μL的对照品溶液依次注入液相色谱仪，测定，得回归方程：y =133 691x-2 507.4，r2 =0.999 7结果表明，黄芩苷在0.12～1. 20 ?g范围内线性关系良好。

    2.1.4 ?精密度试验

    精密吸取10μL的黄芩苷对照品溶液，接连进样6次，测定，RSD值为1.11%，证明仪器精密度良好。

    2.1.5 ?重复性试验

    精密称定黄芩中粉0.5 g，平行6份，制备供试品溶液，测定，RSD值为1.79%，证明该方法重复性良好。

    2.1.6 ?稳定性试验

    取一定量供试品溶液分别在第0，2，4，8，12，24 h注入液相色谱仪，测定，结果黄芩苷峰面积值RSD值为0.69%，证明供试品溶液在24 h内稳定。

    2.1.7 ?加样回收试验

    精密称定黄芩中粉0.5 g，平行5份，回流提起，分别精密移取提取液1 mL（黄芩苷0.085 5 mg/mL）分别精密加入黄芩苷对照品溶液1 mL（黄芩苷0.085 mg/mL），制备供试品溶液，测定，计算得平均回收率为97.23%，RSD为2.17%。

    2.2 ?水提工艺的响应面法优选

    2.2.1 ?响应面数据分析

    （1）设计方案及试验结果在单因素实验基础上，根据Box-Behnken设计的中心组合实验设计原理，以提取时间（A， h）、料液比（B， mL/g）、提取次数（C， 次）为黄芩苷水提工艺中的自变量，进行三因素三水平的实验设计，以黄芩苷的提取率为因变量，进行分析。设计方案及实验结果见表1，其中1、2、9、10、12为中心试验，3、4、5、6、7、8、11、13、14、15、16、17为析因实验。

    提取时间（A， h）、料液比（B， mL/g）、提取次数（C， 次）三个因素经二次多项式回归拟合后，得到提取率（Y）对三因素的二次多项回归方程为：

    Y=16.97+0.20A+0.31B+0.20C-0.35AB-0.34AC+0.28BC-0.78A2-0.33B2-1.26C2

    （2）模型建立及显著性分析采用 Design- Expert 8.0.6 对表2 中的数据进行回归拟合，得到黄芩苷提取参数回归分析结果，如表2所示。

    由表2黄芩苷参数回归分析可知，拟合模型P=0.045 10.05，表明未知因素对该试验影响较小，残差均有随机误差引起。该模型的相关系数R2=0.912 3，说明该模型拟合程度较好，实验误差小。从F值来看，在所选因素范围内，料液比对黄芩苷提取率影响最大，提取时间、提取次数影响较小。交互项AB、AC、BC，P值均大于0.05，说明对黄芩苷提取率影响不显著。二次项A2对提取率影响显著（P<0.05），二次项C2对提取率影响极显著（P<0.01），说明了各种水提工艺与黄芩苷提取率之间并不是简单的线性关系，而是一种非线性关系。综上所述，该模型拟合度较高，可用该模型描述各工艺与黄芩苷提取率之间的关系，可用该模型来合理推测黄芩药材中黄芩苷的最佳水提工艺。

    2.2.2 ?响应面结果及分析

    通过响应面3D图能直观地看出各因素对提取率的影响，其中料液比对黄芩苷的提取率影响加大，提取时间与提取次数影响较小，从交互作用来看，料液比与提取次数的交互作用最为明显，其次是提取次数与提取时间，最后是料液比与提取时间。通过对回归模型求解方程，得出黄芩苷最佳水提工艺条件为：提取时间2.25 h，料液比56.52 mL/g，提取次数2.12次。此條件下黄芩苷的理论提取率为17.103 7%（图1-6）。

    2.2.3 ?验证试验

    为了检验实验模型真实性、可靠性、可行性，进行以下验证试验：精密称定同一批次0.5 g黄芩中粉，平行三次，按照 “2.1.2.2”项下操作，黄芩苷提取率为16.97%，RSD值1.27%，与预测误差仅为0.133 7%，证明通过响应面法优化的黄芩苷水提工艺合理可靠。

    3 ?讨论

    目前黄芩苷提取工艺种类丰富，如：电磁裂解提取工艺、超声提取法、微波提取法等。这些提取方法虽然省时环保，但对仪器设备要求较高，并不符合实际生产生活需求。传统中药提取物多采用口服给药的方式，但黄芩苷的提取多用各种溶度的乙醇作为溶媒[13-15]，无法直接给药和用于药理学实验研究。水煎法是传统中药提取方法，适用范围广，安全系数高，操作简便，经济成本低，更加适用于临床实际需求。

    目前优化黄芩苷的水提工艺多采用正交设计法[16-18]，响应面法鲜有报道，本次试验以黄芩苷的提取率为衡量指标，在单因素的实验基础上，利用响应面法对水提工艺中的提取时间、料液比、提取次数三个因素进行分析研究，优选最佳提取工艺。得出黄芩药材中黄芩苷的最佳水提工艺为：提取时间2.25 h，料液比56.52 mL/g，提取次数2.12次，此条件下，黄芩苷的提取率为17.103 7%，考虑到实际操作条件将工艺条件调整为提取时间2.25 h，料液比57 mL/g，提取次数2次。

    参考文献：

    [1]罗燕子.中药黄芩的化学成分及药理作用的相关研究进展[J].临床合理用药杂志，2018，11（30）：180-181.

    [2]肖红侠，张喜霞，邵世峰，等.黄芩苷对结核分枝杆菌抑菌作用的研究[J].临床检验杂志，2017，35（04）：291-292.

    [3]王婷婷，赵鹏翔，谢飞.黄芩苷的抗肿瘤作用及机制研究进展[J].生物技术进展，2019，9（01）：13-20.

    [4]肖意川，张许，柯培雄，等.黄芩苷在心血管疾病中的药理作用研究新进展[J].广东医学，2018，39（24）：3587-3590.

    [5]吴宜艳，韩杨，李玲玉，等.黄芩苷通过抗氧化对H2O2诱导的SH-SY5Y细胞损伤的保护作用[J].中国医药导报，2018，15（27）：8-11.

    [6]王广志，姜楠，赛凤英，等.黄芩苷对胶原诱导性关节炎大鼠抗炎作用研究[J].中国药物与临床，2017，17（04）：498-501.

    [7]詹铀超，秦笙，陈富.黄芩苷抗呼吸道合胞病作用的研究[J].国际检验医学杂志，2017，38（14）：1907-1909.

    [8]王仁广，贾艾玲，邱智东，等.响应面法优化黄芩中黄芩苷的电磁裂解提取工艺[J/OL].中国实验方剂学杂志：1-7[2019-03-30].https： //doi.org/10.13422/j.cnki.syfjx.20191349.

    [9]刘昊，常仁旭，陈博，等.正交试验优化黄芩中黄芩苷超声提取工艺[J].黑龙江畜牧兽医，2017（22）：162-164.

    [10]邵红，刘昊，赵自冰，等.正交设计法优化黄芩苷微波提取工艺[J].湖南农业科学，2017（09）：92-94.

    [11]杨静，王茜，韩红娟，等.树莓黄酮提取工艺的响应面法和正交法比较[J].食品研究与开发，2015，36（18）：101-105.

    [12]国家药典委员会.中华人民共和国药典[S].一部.北京：化学工业出版社，2015，301.

    [13]雷燕妮，张小斌.中药黄芩苷的提取工藝研究[J].陕西农业科学，2012，58（06）：121-124.

    [14]杨明，陶蕾，王文，等.黄芩中黄芩苷的正交提取工艺及体外抑菌活性研究[J].中兽医医药杂志，2011，30（03）：43-45.

    [15]沙子健，付双，许凤.中药黄芩中黄芩苷的提取工艺研究[J].齐齐哈尔医学院学报，2010，31（12）：1928.

    [16]王聪，唐雪梅，周健，等.黄芩苷的提取工艺及高效液相含量测定[J].现代中药研究与实践，2012，26（03）：53-56.

    [17]刘璐，杨丽杰，李希娜，等.正交设计法优选黄芩苷提取工艺[J].中华中医药学刊，2010，28（07）：1437-1438.

    [18]郭银周，卜秀芹.黄芩中黄芩苷的提取工艺研究[J].中国伤残医学，2013，21（09）：92-94.