一例副猪嗜血杆菌的分离培养及药敏试验
申识川++宋果++王冠杰
摘要：副猪嗜血杆菌（HPS）主要危害保育猪群，引发以脑膜炎、关节炎、多发性浆膜炎等为主要特征的传染病，猪群一旦发病，病死率较高，给养猪业造成重大经济损失。从疑似发生副猪嗜血杆菌病的河南濮阳某猪场无菌采集病料，并进行触片镜检、分离培养、生化试验。结果成功分离到了副猪嗜血杆菌，药敏试验显示，分离菌株对氟苯尼考、泰妙菌素、氟甲砜霉素、头孢菌素、丁胺卡那霉素、头孢噻肟高敏，对红霉素、克林霉素、庆大霉素、环丙沙星、恩诺沙星、链霉素、土霉素低敏。根据药敏试验结果，对发病猪群进行治疗，取得了良好的治疗效果。
关键词：猪；副猪嗜血杆菌；分离培养；药敏试验
中图分类号：S858.28 文献标识码：B 文章编号：1007-273X（2017）010-0013-02
副猪嗜血杆菌（HPS）是一种多形态、非溶血性、不运动、NAD依赖型、革兰氏阴性细小杆菌，属于巴斯德杆菌科嗜血杆菌属。副猪嗜血杆菌只感染猪，有很强的宿主特异性，可以影响2周龄到4月龄的青年猪，主要在断奶后保育舍阶段发病，感染高峰通常见于保育期的4～6周，发病率一般在10%～15%，严重时病死率可达 50%[1]。该菌在特定的条件下，可以侵入猪机体，引发一种以脑膜炎、关节炎、多发性浆膜炎等为主要特征的传染病，又称为猪革拉斯氏病（Glasser′s disease）[2]，主要临床症状表现为咳嗽、呼吸困难、消瘦、跛行和被毛粗乱；主要剖检病变表现为纤维素性胸膜炎、心包炎、腹膜炎、关节炎和脑膜炎等[3]。目前，根据免疫扩散试验，确定该菌有15个血清型，全国各地流行的血清型不完全相同。由于副猪嗜血杆菌血清型多、产生耐药性快，致使临床疫苗免疫和用药效果不理想，给该病的预防和治疗带来很大的困难[4]。相对于传统用药，分离鉴定该菌并进行药敏试验分析是比较有效的治疗方法。
2016年4月11日，濮阳地区某中小规模猪场出现25头47日龄的猪发病，根据患病猪流行病学调查情况、临床症状和剖检变化，疑似副猪嗜血杆菌病。通过无菌采集病猪典型病变组织进行细菌分离培养、镜检和生化鉴定等实验室诊断技术，最终确认分离到的细菌为副猪嗜血杆菌，确诊该猪场所患猪病为副猪嗜血杆菌病。对分离到的细菌进行药敏试验，并根据药敏试验结果进行了治疗，取得了良好的治疗效果，现将其报告如下。
1 材料
1.1 病料
在无菌操作条件下取疑似病猪的肺脏、胸膜、胸腹腔积水、心包积液、心血、关节液。
1.2 培养基
胰蛋白大豆琼脂（TSA）、胰蛋白大豆肉汤（TSB）培养基购自英国OXOID公司。
1.3 试剂
新生牛血清、辅酶I（烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，NAD+）购自长沙虹宇生物科技有限公司。
1.4 细菌染色液
革兰氏染色液购自北京陆桥生物技术有限公司。
1.5 生化试验试剂
氧化酶、甘露醇、吲哚、葡萄糖、半乳糖、果糖、蔗糖、核糖、脲酶和伯胶糖等均购自长沙金标生物有限公司。
1.6 药敏纸片
氟苯尼考、泰妙菌素、头孢菌素、丁胺卡那霉素、氟甲砜霉素、头孢噻肟、红霉素、克林霉素、庆大霉素、环丙沙星、恩诺沙星、链霉素、土霉素均购自长沙虹宇生物科技有限公司。
2 方法与结果
2.1 病理变化
剖检病死猪，发现胸腔内有大量淡红色液体、纤维素性渗出物。肺脏呈纤维素性胸膜肺炎， 肺肿大呈暗紫红色，表面覆有纤维素性渗出物。支气管内有淡红色泡沫样渗出物。心包积液。腹腔内有大量透明黄褐色渗出液， 有的呈胶胨状凝块。全身淋巴结肿大，暗红色。关节肿大，有浆液纤维素性化脓性炎症。
2.2 触片镜检
取发病猪的肺组织、心血、胸水和腹膜面涂片，革兰氏染色，镜检可见革兰氏阴性的细小杆菌，个别两极球杆状革兰氏阴性菌。
2.3 细菌分离培养
无菌取发病猪的肺脏、腹膜、胸水和心血划线接种于含NAD+和5%小牛血清的TSA平板，置37 ℃5%CO2培养箱培养24～48 h[5]，出现无色、透明、湿润、光滑、边缘整齐的针头大小菌落，镜检可见大小不一、形态细长、丝状的革兰氏阴性杆菌。接种无NAD的TSA平板上不生长。而后挑取单个菌落，接种到含有NAD+的TSB培养基中进行纯培养。
2.4 生化试验
挑取纯化菌落接种于氧化酶、甘露醇、吲哚、葡萄糖、半乳糖、果糖、蔗糖、核糖、脲酶和伯胶糖等生化鉴定管中，同时加入0.01%的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）5 μL，置于37 ℃5%的CO2培养箱培养48 h，观察结果见表1。生化试验结果表明，疑似纯培养菌符合副猪嗜血杆菌的生化特性。
2.5 药敏试验
将细菌TSB纯培养物吸取200 μL均匀涂布于TSA平板上，采用纸片法进行药敏试验，置37 ℃5%的CO2培养箱中培养48 h，测量抑菌环直径并判定结果。结果表明该菌对氟苯尼考、泰妙菌素、氟甲砜霉素、头孢菌素、丁胺卡那霉素、头孢噻肟高敏，对红霉素、克林霉素、庆大霉素、环丙沙星、恩诺沙星、链霉素、土霉素低敏。
3 防治
加强日常管理，将发病猪与健康猪隔离饲养；对发病猪舍进行全面消毒，每天早晚各一次，连续5 d；在饮水中添加电解多维减少猪群应激；根据药敏试验结果，对发病猪只用氟苯尼考注射液肌注2 mg/kg，1次/d，连续注射5 d。
4 小结与讨论
根据发病猪只的流行病学、临床症状和病理变化，初步怀疑该病是由副猪嗜血杆菌引起的。通过对采集病料进行显微镜镜检、细菌分离培养、生化试验检测，结果显示，分离到的细菌与副猪嗜血杆菌的生理生化特性相符合，最终判定分离到的细菌为副猪嗜血杆菌，即确定该场猪群所发病为副猪嗜血杆菌病。
随着规模化、集约化养猪的发展，副猪嗜血杆菌病在我国各大猪场的带菌率、发病率和死亡率均呈上升趋势，给我国的养猪业造成了巨大的经济损失[6]。在實际生产中常用大量抗菌药来治疗细菌性疾病，误用、滥用抗菌药对细菌产生较强的药物选择压力，从而使得细菌耐药情况愈加突出[5]。因此，建议在实际生产中，采用细菌体外分离培养与鉴定确诊病原后，结合药敏试验结果有针对性地用药，可以取得较好的治疗效果，同时要避免长期使用一种抗菌药物。
参考文献：
[1] 陈溥言.兽医传染病学[M].第五版.北京：中国农业出版社，2006.
[2] 蔡旭旺.副猪嗜血杆菌的分离鉴定及诊断方法与灭活疫苗的研究[D].武汉：华中农业大学，2006.
[3] [美]斯特劳.猪病学[M].第八版.赵德明，张仲秋，沈建忠，译.北京：中国农业大学出版社，2003.
[4] 高 丰，罗 毅，成 军，等.副猪嗜血杆菌感染的诊断与防治[J].动物医学进展，2002，23（6）：101-103.
[5] 张 悦，李蓓蓓，魏建超，等.上海副猪嗜血杆菌分离鉴定及其耐药性分析[J].中国动物传染病学报，2015，23（4）：25-30.
[6] 李志勇.海南省规模化猪场副猪嗜血杆菌病的分子流行病学调查和综合防治措施[D].南宁：广西大学，2010.
