Apelin-13对急性心肌梗死家兔的治疗作用

    张彦宏 张波 李显东

    

    

    【摘要】 目的 探讨Apelin-13对急性心肌梗死（AMI）家兔的治疗作用。方法 30只雄性家兔， 随机分为假手术组、AMI对照组和Apelin组， 各10只。术后开始给药， Apelin组耳缘静脉注射Apelin-130.1 mg/（kg·d）， 連续7 d， AMI对照组及假手术组注射等量生理盐水。比较三组家兔血管内皮生长因子（VEGF）、梗死边缘区微血管计数、凋亡指数（AI）、心脏重量/体重， 观察三组心肌损伤程度及胶原沉积情况。结果 假手术组VEGF含量、梗死边缘区微血管计数、AI、心脏重量/体重分别为（44.94±2.76）ng/L、（7.820±1.059）个、（42.84±2.65）%、（1.90±0.12）‰， 显著低于AMI对照组的（59.72±

    4.17）ng/L、（13.540±1.704）个、（73.97±5.03）%、（2.70±0.01）‰， 差异均有统计学意义（P<0.05）。Apelin组VEGF含量、梗死边缘区微血管计数分别为（68.65±4.91）ng/L、（16.130±2.220）个， 均高于AMI对照组， AI及心脏重量/体重分别为（65.73±4.42）%、（2.60±0.15）‰， 均低于AMI对照组， 差异均有统计学意义（P<0.05）。HE染色可见假手术组家兔心肌组织结构排列整齐， AMI对照组可见心肌组织中有广泛的炎性细胞浸润， 心肌纤维断裂， 排列紊乱， 心肌细胞坏死。Apelin-13组可见炎性细胞浸润、心肌纤维断裂比AMI对照组减轻。结论 Apelin-13可促进AMI家兔梗死周围新生血管生成、侧支循环形成， 缩小心肌梗死面积， 且可有效抑制心肌细胞凋亡、减轻心肌细胞损伤、改善AMI家兔心肌重构。

    【关键词】 Apelin-13;急性心肌梗死;心肌细胞凋亡;心肌重构

    DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2020.07.085

    Effect of Apelin-13 on the treatment of acute myocardial infarction in rabbits ? ZHANG Yan-hong， ZHANG Bo， LI Xian-dong. Department of Emergency Medicine， Jilin Provincial Peoples Hospital， Changchun 130021， China

    【Abstract】 Objective ? To discuss the therapeutic effect of apelin-13 on acute myocardial infarction （AMI） in rabbits. Methods ? A total of 30 male rabbits were randomly divided into sham operation group， AMI control group and Apelin group， with 10 rabbits in each group. After operation， Apelin-130.1 mg/（kg·d） was injected into the ear margin of Apelin group for 7 d. The same amount of normal saline was injected into the control group and sham operation group. The vascular endothelial growth factor （VEGF）， microvessel count in infarcted margin， apoptotic index （AI）， heart weight / body weight were compared in three groups of rabbits， and the degree of myocardial injury and collagen deposition of three groups were observed. Results ? The VEGF content， microvessel count in infarcted margin， AI and heart weight / body weight were （44.94±2.76） ng/L， （7.820±1.059） pieces，

    （42.84±2.65）% and （1.90±0.12）‰ in sham operation group， which were significantly lower than （59.72±

    4.17） ng/L， （13.540±1.704） pieces， （73.97±5.03）% and （2.70±0.01）‰ in AMI control group， and their difference was statistically significant （P<0.05）. The VEGF content and microvessel count in infarcted margin were （68.65±4.91） ng/L and （16.130±2.220） pieces in Apelin group， which were higher than those in the control group， and AI and heart weight / body weight were （65.73±4.42）% and （2.60±0.15）‰ respectively， which were lower than those in the AMI control group. Their difference was statistically significant （P<0.05）. HE staining showed that the myocardial tissue structure of the sham operation group was neatly arranged; AMI control group showed extensive inflammatory cell infiltration， myocardial fiber rupture， disordered arrangement， and myocardial cell necrosis; Apelin-13 group showed inflammatory cell infiltration， and myocardial fiber rupture is reduced compared with AMI control group. Conclusion ? Apelin-13 can promote neovascularization and collateral circulation formation around AMI rabbit infarction， reduce the area of myocardial infarction， and can effectively inhibit myocardial cell apoptosis， reduce myocardial cell damage， and improve myocardial remodeling.

    【Key words】 Apelin-13; Acute myocardial infarction; Cardiomyocyte apoptosis; Myocardial remodeling

    AMI是冠状动脉粥样硬化性心脏病的主要分型之一， 极易引起心力衰竭， 严重威胁人类健康。Apelin是从牛胃分泌物中提取出的一种新的血管活性肽， 具有许多重要的生物学作用[1]。Apelin-13 作为 Apelin 亚型之一， 具有很强的生物活性。大量的实验研究证实Apelin-13具有增强心肌收缩力、降压、减轻心脏负荷、减少心肌损伤、调节水盐代谢及体液平衡等多种心血管保护作用[2， 3]， 本实验旨在研究Apelin-13对AMI家兔的治疗作用， 从而为AMI的诊治提供新的治疗方法。具体研究结果报告如下。

    1 材料与方法

    1. 1 材料 选取雄性家兔30只（吉林大学动物实验中心提供）， 体重2.0～3.0 kg， 将其随机分为假手术组、AMI对照组、Apelin组， 每组10只。

    1. 2 方法

    1. 2. 1 AMI模型制备[3] 开胸结扎家兔左冠状动脉前降支， 冠状动脉结扎成功与否依靠心电图ST段抬高， 局部心肌變暗红， 节段性运动不良确认， 假手术组只开胸剪破心包而不结扎冠状动脉。

    1. 2. 2 给药方法 术后开始给药， Apelin组耳缘静脉注射Apelin-13（长春宝信生物制品公司提供）0.1 mg/（kg·d），

    连续7 d， AMI对照组及假手术组注射等量生理盐水。

    1. 2. 3 标本采集 术后2周采耳缘静脉血5 ml， 以10%氯化钾耳缘静脉注射处死动物， 摘取心脏。

    1. 3 观察指标

    1. 3. 1 血清VEGF 采用酶联免疫吸附法测定， 按试剂盒操作。

    1. 3. 2 梗死边缘区微血管计数 在左室乳头肌横切面处切取心肌组织， 经甲醛固定、常规脱水后再经石蜡包埋， 切成组织切片。将组织切片进行免疫组化染色， 计算梗死边缘区微血管数量， 免疫组化步骤按试剂盒说明书操作。不是必须出现血管腔以及红细胞， 凡染成棕色的单个内皮细胞及内皮细胞丛都被看作一个微血管。具体计数方法：低倍镜下找到梗死边缘区组织， 切换为200倍镜后观察并计算微血管数， 每张切片观察5个视野区， 取均数为最后计数。

    1. 3. 3 心肌细胞凋亡检测 自结扎线下0.5 cm处取心肌组织， 将心肌组织置入10%多聚甲醛中， 固定24 h

    后行常规石蜡包埋、切片， 贴附于表面涂有多聚赖氨酸的载玻片上。检测心肌细胞凋亡采用Tunel法， 按照试剂盒的说明书进行操作。光镜下观察细胞核中呈棕黄色颗粒染色为凋亡细胞。每张切片随机选取5个视野（×400）， 算出凋亡细胞和正常细胞的数量， 得出AI。AI=视野中凋亡细胞数量/视野中细胞总数量×

    100%。

    1. 3. 4 称取心脏重量， 计算心脏重量/体重。

    1. 3. 5 心脏组织病理学观察 取左心室心肌甲醛固定， 石蜡包埋， 行光镜分析， 观察心肌损伤程度及胶原沉积。

    1. 4 统计学方法 采用SPSS24.0统计学软件对数据进行统计分析。计量资料以均数±标准差（ x-±s）表示， 采用t检验。P<0.05为差异具有统计学意义。

    2 结果

    2. 1 三组血清VEGF含量、梗死边缘区微血管计数、AI及心脏重量/体重比较 假手术组VEGF含量、梗死边缘区微血管计数、AI、心脏重量/体重低于AMI对照组， 差异均有统计学意义（P<0.05）。Apelin组VEGF含量、梗死边缘区微血管计数均高于AMI对照组， AI及心脏重量/体重均低于AMI对照组， 差异均有统计学意义（P<0.05）。见表1。

    2. 2 心肌损伤程度 HE染色可见假手术组家兔心肌组织结构排列整齐（见图1）。AMI对照组可见心肌组织中有广泛的炎性细胞浸润， 心肌纤维断裂， 排列紊乱， 心肌细胞坏死（见图2）。Apelin-13组可见炎性细胞浸润、心肌纤维断裂比AMI对照组减轻（见图3）。

    2. 3 胶原沉积 经特殊染色（Masson染色）， 假手术组心肌细胞周围可见少量蓝色的胶原成分（见图4）。AMI对照组可见大量增粗的胶原纤维沉积在血管及间质（见图5）。Apelin-13组与AMI对照组相比， 胶原沉积显著减少（见图6）。

    3 讨论

    VEGF可以促进血管内皮细胞生长、诱导血管形成， 从而促进血管新生、侧支循环的形成及心肌细胞再生， 因此可对AMI患者发挥重要的心脏保护作用[4]， 血管新生可促进缺血周围组织侧支循环的建立， 良好的侧支循环可减少心肌缺血和心肌梗死范围、保护冬眠心肌及顿抑心肌、改善心功能。早期促进心肌梗死边缘区新生血管形成， 能改善AMI后心脏功能， 改善疾病预后。本研究显示， Apelin-13可明显增加AMI后VEGF及梗死边缘区微血管数， 表明Apelin-13可促进AMI家兔梗死周围新生血管生成、减少梗死面积， 尽早形成侧支循环。

    心肌重构是由于心肌细胞及间质进行性改变引起的心脏重量、体积及形状结构的变化， AMI后愈合和心肌纤维化是同时进行的动态过程， 心肌纤维化是心肌正常组织中成纤维细胞聚集、活化、增生及细胞外基质代谢紊乱、胶原过度沉积的病理生理过程， 是AMI后心力衰竭的重要原因。AMI后心室内压力改变及内分泌和旁分泌的调节作用， 都会导致非梗死区域结缔组织增生， 引起非梗死区反应性纤维化， 反应性纤维化会改变心室顺应性、增加心室壁僵硬度， 从而影响心功能。而且， 这种间质纤维化还会干扰心脏正常的电传导从而诱发心律失常的发生[5， 6]。本研究显示Apelin-13可降低AMI家兔心脏重量/体重， 减少心肌胶原沉积。有实验证实细胞核转录因子-κB（NF-κB）参与实验小鼠早期血管炎症反应及继发冠状动脉中层的增厚[7]。Apelin-13可减轻心肌纤维化， 其机制可能与阻碍血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂（AngⅡ）诱导的胶原蛋白生成、降低转化生长因子β1（TGF-β1）及结缔组织生长因子的活性、抑制NF-κB表达有关。还有研究证明给予Apelin-13可改善AMI 大鼠血流动力学， 有效抑制脑钠肽， 调节基质金属蛋白酶-2（MMP-2）/组织抑制因子-1（TIMP-1）平衡， 从而抑制心肌纤维化， 保护心肌 [7]。

    心肌细胞凋亡是发生心肌重构及细胞功能紊乱的另一个重要原因， 有研究显示， 当心肌梗死时， AMI动物模型及人均表现心肌细胞凋亡增加， 促凋亡相关基因Bax、Bak、凋亡蛋白（caspase-3）上调、抗凋亡蛋白Bcl-2蛋白下调[8]。因此提出抑制细胞凋亡可能是阻止心肌梗死的有效方法[9]。本研究结果显示， Apelin-13可明显抑制心肌细胞凋亡， 其机制考虑为通过PI3K/Akt信号系统使Bax、Bak升高 、caspase-3表达降低， Bcl-2 表达升高所致[10]。还有研究显示Apelin-13可减轻氧化应激和心肌炎症反应， 对心肌细胞凋亡有改善作用[11]。

    综上所述， Apelin-13可促进AMI家兔梗死周围新生血管生成、尽早形成侧支循环、有效抑制心肌细胞凋亡、减轻心肌细胞损伤、改善心肌重构、减少梗死面积， 可为急性心肌梗死的诊治提供新的治疗方法。

    参考文献

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    [7] 里宏晴， 張志， 焦慧， 等. Apelin-13对糖尿病大鼠心肌纤维化的影响. 解放军医学院学报， 2013， 34（6）：621-624.

    [8] Li X， Wang H， Ma YX， et al. Berberine inhibits the ischemia-reperfusion injury induced in flammatory response and apoptosis of myocardial cells through the phosphoinositide 3-Kinase/RAC-α serine/threonine-protein kinase and nuclear factor-κB signaling pathways. Exp Ther Med， 2018， 15（2）：1225-1232.

    [9] Xu DW， Liu RX， Meng L， et al. MicroRNA-204 protects H9C2 cells against hypoxia/reoxygenationinduced injury through regulating SIRT1-mediated autophagy. Biomed pharmacother， 2018（100）：15-19.

    [10] Yang Y， Zhang XJ， Cui HY， et al. Apelin-13 protects the brain against ischemia/reperfusion injury through activating PI3K/Akt and ERK1/2 signaling pathways. Neurosci lett， 2014（568）：44-49.

    [11] Zhang XM， Hu WY， Feng F， et al. Apelin-13 protects against myocardial Infarction-induced myocardial fibrosis. Mol Med Rep， 2016， 13（6）：5262-5268.

    [收稿日期：2019-10-16]