不同年龄哈萨克羊卵巢卵泡分布及组织学特征

    彭宏刚

    

    

    

    摘要：哈萨克羊作为中国三大粗毛羊品种之一，是我国宝贵的畜禽遗传资源之一，研究不同年龄哈萨克羊卵巢中卵泡的分布及各级卵泡形态学特征，可为进一步开展其卵巢基础生理研究和品种遗传资源的开发与利用提供参考依据。试验采用组织学方法，分别对胎儿、羔羊、青年母羊、老龄母羊卵巢切片进行分析，结果表明不同年龄哈萨克羊卵泡分布区域相异，胎儿卵巢组织中以原始卵泡为主，主要分布于皮质最外层，内含较大的卵母细胞核。羔羊卵巢组织中发育卵泡较少；青年母羊发育卵泡则较多，主要分布于与髓质交界的区域。发育卵泡外周常环绕单层或多层立方状颗粒细胞。随着年龄增长，老龄母羊中逐渐以闭锁卵泡为主，哈萨克羊闭锁卵泡卵母细胞皱褶，核固缩或颗粒细胞分布杂乱与基底膜分离。

    关键词：哈萨克羊；卵巢；卵泡；分布；组织学特征

    中图分类号：S813；S826 文献标识码：A 文章编号：1007-273X（2017）010-0005-02

    哺乳动物卵巢内含有数量庞大的腔前卵泡，然而在生理条件下，这些卵泡只有不到1%能发育到成熟排卵阶段，其余都由于闭锁而退化，这是对雌性繁殖潜力的极大浪费。哈萨克羊是新疆原产的中国三大粗毛羊品种之一，肉脂兼用，具有较高的肉脂生产性能。哈萨克羊是我国宝贵的畜禽遗传资源之一，作为母系品种参与了新疆细毛羊和中国卡拉库尔羊品种的培育。研究表明，卵巢所处的年龄、发情周期等的不同会影响卵泡对外界激素的敏感性，卵巢内各级卵泡的构成也会随着年龄的变化而发生改变。本研究旨在对比不同年龄哈萨克羊个体卵巢中卵泡的分布与各级卵泡组织学特征，为进一步开展卵巢基础生理研究和品种遗传资源的开发与利用提供参考依据。

    1 材料与方法

    1.1 试验材料

    1.1.1 卵巢组织的采集与处理 不同年龄阶段雌性哈萨克羊卵巢包括三月龄胎儿、3～6月龄羔羊、1～3岁青年母羊以及老龄母羊（5岁以上）从当地屠宰场采集，保存于27～32 ℃添加有100 μg/mL青霉素、100 μg/mL链霉素的生理盐水或PBS缓冲液中，1 h内运回实验室。在体视显微镜下，去除卵巢附属物，十字剖分成1～2 mm3大小的组织块用4%多聚甲醛PBS液固定，进行组织学观察。

    1.1.2 主要儀器和设备 组织切片机、超净工作台、光学显微镜、眼科手术刀、手术剪和35 cm培养皿。

    1.1.3 主要试剂 生理盐水，PBS液，苏木素-依红染液， 4%多聚甲醛-PBS液。

    1.1.4 主要溶液的配置

    （1）苏木素-依红染液。苏木精染液配方（20×）：苏木精0.5 g，铵汞24 g，水50 mL，NaIO3 0.5 g，甘油30 mL，冰醋酸2 mL（细胞核染色，碱性），用时20倍稀释。1%伊红染液配方：1 g伊红溶于100 mL蒸馏水中。

    （2）无钙镁PBS溶液。KCl 0.2 g，KH2PO4 0.2 g，NaCl 8.0 g，Na2HPO4·12H2O 2.88 g，Mill-Q超纯水定容到1 L，pH 7.0～7.4，用0.22 μm滤膜过滤灭菌后4 ℃保存。

    （3）4%多聚甲醛-PBS溶液。4 g多聚甲醛，溶于100 mL PBS液中4 ℃保存。

    1.2 试验设计

    本研究旨在分析不同年龄哈萨克羊卵巢中卵泡的分布与组织学特征。样本采集时左右卵巢分别对应编号，固定后用常规组织学方法对比不同年龄阶段哈萨克羊卵巢组织中卵泡的分布，以及不同发育阶段卵泡的组织学特征。

    1.3 组织切片与染色

    卵巢组织块固定后经梯度乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋后，10 μm连续切片，HE染色后光镜下观察。卵泡分类标准参考相关文献，分为原始卵泡和发育卵泡（过渡卵泡，初级卵泡和次级卵泡）。形态正常卵泡具有完整的卵母细胞，颗粒细胞排列规则，无固缩细胞核，异常卵泡卵母细胞皱褶或颗粒细胞分布杂乱与基底膜分离，核固缩。

    卵泡密度的衡量：本研究采用平均每张切片上的卵泡数量作为卵泡密度。

    各级卵泡构成：对计数切片上随机5个高倍视野下（×200）具有明显卵母细胞核的健康卵泡和闭锁卵泡分别进行计数，对健康的各级卵泡数量分别记录，计算卵泡比例。

    2 结果与分析

    2.1 不同年龄阶段个体卵巢中卵泡的分布

    卵巢组织学切片观察发现，卵巢中腔前卵泡主要分布在皮质部，且分布不均匀。原始卵泡处于皮质最外层，在致密的白膜结构下，密度较大，常聚集成团，这种现象在胎儿卵巢组织中尤为明显（图1a）；初级和次级卵泡则分布于卵巢内部与髓质交界的区域，且密度较低。羔羊卵巢中发育卵泡较少（图1b），青年母羊发育卵泡较多（图1c），老龄母羊中闭锁卵泡增多（图1d）。

    2.2 各级卵泡组织学特征

    试验结果表明，原始卵泡有较大的卵母细胞核，外面包裹单层的扁平颗粒细胞，数量从0～13不等。胎儿卵巢中原始卵泡与出生后原始卵泡有很大的差异，胎儿组织中原始卵泡颗粒细胞较少，且大多没有形成卵泡样结构。胎儿卵泡中有时会发现合胞体现象，且基底膜不明显，完整的基底膜原始卵泡主要发现于青年和老龄母羊卵巢中（图1e）。

    初级卵泡外周环绕单层立方状或柱状颗粒细胞，数量增多，有明显的基底膜隔离卵泡与间质细胞，颗粒细胞数量增多，在羔羊卵巢中常发现由扁平和立方状颗粒细胞混杂的过渡性初级卵泡（图1f）。

    次级卵泡外周环绕2～7层立方状颗粒细胞，基底膜明显，具有完整的卵泡结构和透明带。颗粒细胞数量急剧增加，数量从几十到数百不等（图1c）。

    闭锁卵泡通常表现为两种特征（图1g，图1h），卵母细胞皱褶，核固缩或颗粒细胞分布杂乱与基底膜分离。但是因为胎儿卵巢组织中多为原始卵泡阶段，且含有较多的卵原细胞，因此闭锁的卵泡在组织学下较难辨认。

    3 小结与讨论

    从试验结果可知，绵羊卵巢中从胎儿时期开始就含有大量的原始卵泡，随着年龄的增长，卵泡数量不断减少。而伴随着这一数量减少的过程，卵泡发育不断启动，原始卵泡颗粒细胞层增殖，形状由扁平转变为柱状或立方状，变为单层或多层的发育卵泡，直至窦腔排卵阶段。但实际上最终发育到成熟阶段的卵泡相对卵泡总数而言数量是很小的，这一现象说明卵泡发育过程中大部分的卵泡发生闭锁，这应该与优势卵泡的形成机制有关[1]。

    原始卵泡多位于皮质浅层，紧靠白膜，且密度较大，通常没有血管存在。而发育卵泡主要位于皮质的中层和内层，且发育程度越高，位置越靠近卵巢内部。多层颗粒细胞的次级卵泡位于皮质与髓质交界的区域，这些区域血管较多，结构相对松散。上述观察结果与其他关于家羊的报道基本一致[2]。哈萨克羊卵泡的这种分布规律表明卵泡的发育需要血管体系提供必要的激素和生长因子的刺激以及能量支持。卵巢中大部分原始卵泡都处于相对静止的休眠状态，可能与能量供给较少有关。陈大元[3]的研究结果表明发育卵泡需求的能量供給除供卵泡自身生长所需外，还可能累积和储存在卵子中，为将来的胚胎早期发育提供必需的能量和DNA蛋白质的合成底物。

    总之，本试验结果表明，哈萨克羊卵巢中原始卵泡位于皮质的最外层，紧靠白膜下方，密度较大，而发育卵泡位于皮质里层。青年母羊卵巢内发育程度较高，卵泡可能对外界因子敏感，同时材料易于从屠宰场获得，可以作为卵巢生理基础研究试验的材料来源。而胎儿和羔羊卵巢中原始卵泡数量较多，且构成相对单一，是研究原始卵泡发育进程的理想材料。

    参考文献：

    [1] NANDI S，GIRISH KUMAR V，RAMESH H S，et al. Isolation and culture of ovine and bubaline small and large pre-antral follicles：effect of cyclicity and presence of a dominant follicle[J].Reprod Domest Anim，2009，44：74-79.

    [2] ISLAM M R，KHANDOKER M A，AFROZ S，et al. Qualitative and quantitative analysis of goat ovaries，follicles and oocytes in view of in vitro production of embryos[J].J Zhejiang Univ Sci B，2007，8（7）：465-469.

    [3] 陈大元.受精生物学：受精机制与生殖工程[M].北京：科学出版社，2003.