链球菌2型对恩施黑猪致病性的研究

    谭仕旦

    

    

    

    摘要：为研究猪链球菌2型对恩施黑猪的致病性，采用分组试验法，选取同窝8头恩施黑猪，随机分组，试验组（6头）注射猪链球菌2型菌液进行攻毒试验，对照组（2头）正常饲喂，观察记录50 h的试验情况。结果表明，试验组猪全部发病，体温升高、呼吸迫促、败血症和神经症状；剖检病（处）死猪尸体可见不同程度的脑膜充血淤血、关节炎、心肌炎、肺淤血、出血性炎症等病理变化，对照组无异常。证实了猪链球菌2型对恩施黑猪有很强的致病性。

    关键词：猪链球菌2型；恩施黑猪；致病性；攻毒试验

    中图分类号：S858.28；S855.1+1 文献标识码：B 文章编号：1007-273X（2017）010-0007-02

    猪链球菌病（Swine streptococcosis）是由猪链球菌引起猪的一种发病急、死亡率高的细菌性传染病，被列入我国动物传染病中的二类病，人畜共患病，严重地威胁着我国养猪业的发展和人类食品公共卫生安全，引起了人们的高度重视。近年来，依据链球菌荚膜抗原的不同，人们将其分为 35 个血清型（1～34型和1/2 型）[1]。其中猪链球菌 2型（Strptococcus suis type 2， 简称SS2）被认为是猪链球菌 35个血清型中分布最广致病性最强的一个血清型，人感染后可引起化脓性关节炎、脑膜炎、心内膜炎和中毒性休克综合症等[2]。1998年江苏海安县暴发猪链球菌病，25人感染，死亡14人；2005年7月四川省资阳市暴发猪链球菌病，并见有人感染而引起死亡的报道[1]。

    近年来，因恩施黑猪的肉质好，养殖效益高，恩施黑猪养殖量日益增加，但在养殖生产过程中，时常发生疑似链球菌混合感染的病例。为了有效防控黑猪链球菌病的发生，特开展本次试验。

    1 材料与方法

    1.1 菌株

    猪链球菌2型菌株[3]来源于长江大学动物科学院实验室分离制备的菌液。

    1.2 试剂

    TSA、TSB购自上海生工生物工程股份有限公司，按说明书制备培养基；生化鉴定试剂购自杭州天河微生物有限公司；猪链球菌2型高免血清由长江大学动物科学院制备并保存[4]。

    1.3 试验动物

    试验猪选取90日龄、体重25 kg左右的同窝恩施黑猪，购自恩施咸丰尖山乡某农户。

    选择猪群采食量正常，试验前用灭菌拭子采集鼻腔、扁桃体样本检测SS2为阴性，同时对颈静脉采血，用ELISA方法检测其SS2抗体均为阴性。

    1.4 菌种的复苏与菌液的制备

    室温下解冻菌种，在无菌条件下，用接种环挑取少许菌种，以分区划线法接种在TSA平板上，37 ℃恒温培养24 h。眼观复苏菌种在TSA平板上的菌落大小、边缘整齐度、湿润度、隆起度、表面光滑度、颜色等。挑选单个可疑菌落作标记后，挑取少许按常规方法进行革兰氏染色，观察革兰氏染色后细菌在显微镜下的状态。取镜检后确认的细菌按常规方法接种于TSA平板中，37 ℃恒温培养24 h备用。挑取单菌落接种THB培养基中，37 ℃培养18 h。各菌平板法计数后，调整菌液浓度至1×109 CFU/mL，备用。

    1.5 試验猪的感染与临床观察

    本试验分A、B两个组，A组为6头恩施黑猪，B组为2头恩施黑猪。试验前将A、B两组分别饲养在独立的栏中，预试期7 d。攻毒试验前测量每头猪的体温。

    取“1.4”中制备好的菌液，对A组猪采用颈部肌肉注射，每头注射6 mL，为试验组。B组不注射为对照组。攻毒后，保障充足的饲料和饮水，每天观察猪的临床表现，如饮食情况、体温变化、跛行和神经症状等。每4 h测量全部猪的直肠温度。

    1.6 试验猪的病料采集与处理

    死后立即解剖、拍照，无菌收集其肝脏、脾脏、心血、脑脊液、胃大小弯水肿液、肠淋巴结等，分别放入液氮罐和甲醛中固定，观察记录病死猪的病理学变化。对未死的试验猪50 h后进行人工处死，记录各器官的病理变化，进行细菌涂片、染色及镜检，并在TSA平板上划线分离培养。

    1.7 病料细菌培养计数

    尸体剖检取实质器官，淋巴结、肝、脾、肺、肾称重后按10 mL/g加灭菌生理盐水，充分研磨，倍比稀释至10-8、10-9、10-10、10-11、10-12、10-13稀释度。每个稀释度取10 μL涂布法接种3个TSA平板，37 ℃恒温箱培养24 h，检验平板。

    1.8 免疫器官的病理学观察

    将试验猪主要病变组织按常规技术进行细胞病理学及组织病理学检验，并记录结果。

    2 结果与分析

    2.1 临床症状

    对照组的猪饮食、体温等均正常，无明显的临床症状。试验组的猪接种猪链球菌2型菌液均出现临床症状和病理变化，接种3 h后出现了如扎堆、精神委顿、食欲不振或废食、结膜潮红、树枝状充血，流泪，可见黏液样鼻涕流出。仔细观察黑猪的皮肤色泽，可见颈部、耳廓、腹下及四肢下端皮肤发绀，有出血点，整个试验过程猪喜卧，皮肤肌肉颤抖，粪便干燥，便秘且个别粪便夹血，有个别猪拉稀。病情严重的临死前出现共济失调、角弓反张等神经症状。其中有两头猪在接种后35～48 h内死亡。攻毒后体温上升。

    2.2 病理变化

    对照组进行剖检，眼观和显微镜下观察组织切片均为正常组织状态，无病变。

    对试验组已经死亡的猪及濒死期处死的病猪进行剖检，病变主要表现为败血症症状（图1），病猪腹部皮下有出血点，血液凝固不良；肾脏有点状出血点，被膜难剥离，肾皮质弥散性出血；肝脏肿大，表面有出血点，质度变脆；肺脏水肿，淤血；全身淋巴结肿大、出血，尤其颌下淋巴结、腹股沟淋巴结和肠系膜淋巴结表现最为明显；心脏内膜有出血点，心肌质地变软；脾脏肿大、出血；扁桃体肿大，有出血点；胃内膜出血。

    2.2.1 心脏病变 试验组猪心肌组织结构破坏，闰盘消失；心肌细胞颗粒变性，肿大，胞浆中见大量红色蛋白性颗粒（图2）；心肌细胞水泡变性，肿胀、淡染，有的细胞呈空泡状。对照组猪心肌结构清晰（图3）。

    2.2.2 肝脏病变 试验组猪肝小叶结构被破坏，索状结构消失，肝窦扩张，充满红细胞和其他血细胞（图4）；细胞核凝固溶解，肝细胞肿胀，出现空泡样变性，中央静脉发生淤血。对照组猪肝细胞索明显可见。

    2.2.3 脾脏病变 试验组猪脾脏可见大面积出血，红白髓混乱，脾小结不明显，嗜中性粒细胞浸润，淋巴细胞减少；坏死性脾炎，出血坏死部分细胞脱落。

    2.2.4 肺脏病变 试验组猪肺脏可见间质性肺炎，肺泡隔充血、水肿，炎性细胞浸润，间隔明显增宽，肺泡缩小；有的在肺泡间质可见大量纤维素渗出物和少量中性炎性粒细胞，脱落的肺泡上皮细胞。对照组猪肺泡壁薄、肺泡腔内没有黏液等异物。

    2.2.5 肾脏病变 试验组猪肾小球体积肿大，充满整个肾小囊；肾小管上皮细胞肿胀、出血（图5），管壁增厚，局部肾小管上皮细胞开始脱落。对照组猪肾小球、肾小管清晰可辨，未见异常。

    2.3 细菌分离镜检

    取实质器官淋巴结、肝、脾、肺、肾病料培养的菌落进行细菌染色、镜检，病料中培养出了与攻毒株SS2形态特征完全相同的细菌菌落。

    3 小结与讨论

    以链球菌2型对恩施黑致病性的临床观察和组织病理学观察得出结论，猪链球菌2型对恩施黑猪具有很强的致病性。从试验的组织病理学观察结果可见，感染猪呈现多器官组织出血为主的急性败血症变化，特别是肺脏、淋巴结、脾脏和肾脏出血较為严重，此外也可见脑膜炎、心肌炎和关节炎等病变，这与崔立等[5]用SPF巴马小型猪研究结果一致。本次试验用猪链球菌2型菌株对恩施黑猪进行攻毒成功复制了该病，其临床症状和病理变化已基本清楚，但由于猪链球菌的血清型多，致病性复杂多变，关于猪链球菌2型感染动物的致病机制虽有一些国内外学者做了一定的研究，但仍不完全清楚，还有待于继续深入研究。

    参考文献：

    [1] 郑世军，宋清明.现代动物传染病学[M].北京：中国农业出版社，2013.316.

    [2] TANG J，WANG C，FENG Y，et al. Streptococcal toxic shock syndrome caused by streptococcus suis serotype 2[J].PLoSM ed，2006，3（5）：151.

    [3] 刘国平，梁雄燕，李江华，等.猪链球菌2型昆明鼠动物病理模型的建立[J].中国兽医学报，2008，28（7）：795-798.

    [4] 刘国平，胡利群，杨小林，等.猪链球菌2型高免血清的制备及临床应用[J].黑龙江畜牧兽医，2008（10）：86-88.

    [5] 崔 立，朱建国，华修国，等.猪链球菌2型四川株与江苏株对SPF猪的致病性[J].上海交通大学学报，2006，24（1）：54-57.