武汉市马源肠球菌感染现状分析
兰彦芳 余刚 丁鹏 罗厚强
摘要：抗生素的不科学应用致使肠球菌（Enterococcus）耐药性越发严重，感染率日益升高。为减少武汉市马源肠球菌耐药现象的发生、降低其感染率，通过查阅国内外相关文献并进行分析，得出如下结论：①马源肠球菌研究资料相当匮乏;②马源肠球菌耐药性及致病性日益严重。针对以上结果提出以下对策：①对武汉市各地马匹进行肠球菌遗传特性分析，比较不同环境对肠球菌进化的影响，为马源肠球菌的耐药及致病机理研究提供参考;②对马源肠球菌主要抗生素即氨基糖苷类和万古霉素耐药的生物特性及遗传背景进行探索，为控制该病原菌耐药基因的传播提供理论依据;③筛选马源肠球菌主要毒力基因，并通过敲除方式探讨其致病机理，为马兽医临床提供参考。结合耐药及毒力特征，制订适合马匹的用药指南，降低马兽医临床治疗难度，为军人运动会及马术赛事的发展提供基础和保障。
关键词：马源肠球菌（Enterococcus）;耐药性;致病性;用药指南;军人运动会
中图分类号：R378.1 ? ? ? ?文献标识码：A ? ? ? ?文章编号：1007-273X（2019）08-0005-04
肠球菌（Enterococcus）分布广泛，正常存在于自然界中，属于条件性致病菌[1，2]。肠球菌耐药性复杂，抗生素的不科学应用更加加重菌株的耐药性，从而致使肠球菌引起败血症、皮肤软组织感染及心内膜炎、阴道感染等多种疾病，尤其当家畜免疫力低下时更易发生。目前，家畜感染率逐渐升高，使得养殖业等损失惨重[3]。关于马源肠球菌引起的疾病报道虽少，但部分地区马产业亦受到了影响。因此，本文从武汉市马源肠球菌遗传特性、耐药性和致病性三个方面进行分析，挖掘马源肠球菌耐药及致病机理，从耐药性和致病性两者相关性出发对竞赛马匹制订合理的用药指南，旨在为武汉市乃至我国马匹疾病的防治提供一定的科学依据。
1 ?研究背景
1.1 ?我国马产业发展现状
我国现代马产业机构主要由两部分构成：畜牧业发展的牧场和休闲俱乐部娱乐活动。随着时代不断进步，富贵阶层人数逐渐增加，奥运会等综合赛事大量举行（如第七届世界军人运动会马术运动），马术（赛马）运动在中国开始逐渐流行，直接或间接参与马术（赛马）的马匹及人群亦日渐增多，因此马产业逐渐发展为我国经济发展转型的新的增长点。
1.2 ?賽事马匹的重要性
2019年世界军人运动会将在武汉举行，其中马术比赛将在武汉商学院（以下简称武商院）进行，为此武商院已从欧洲购买29匹军运会比赛用马，这些马匹不仅价值昂贵，更是因为经过调教和训练成为了专业“运动员”，而马匹疾病的防治也成为世界军人运动会马术比赛顺利完成的基础保障之一。对此我们要更加重视，应制订科学、有效的预防和控制策略，以维护马匹健康，助力军运会乃至今后马产业更好地发展。
1.3 ?地理环境差异性
武汉市属亚热带季风性湿润气候区，具有雨量充沛，夏高温，冬季稍凉湿润等特点，与欧洲气候有差异，进口马匹易发生应激反应及免疫力低下等不良现象，这些均为军运会竞赛马匹感染致病性肠球菌创造了有利条件。此外，马源肠球菌耐药性复杂，最后一道防线-万古霉素已被突破[4]，因此可能严重威胁军运会马匹健康，甚至给马产业带来巨大经济损失。
2 ?研究现状
2.1 ?肠球菌生物学特征
不同环境、不同地区来源的菌株其基因组均存在差异性，其在进化关系中具有不同的特征[5]。因此，对肠球菌的遗传背景进行研究，寻找不同环境来源的菌株在进化上的地位，可为马源肠球菌的耐药、致病机理及以后病原菌感染和致病机制研究工作提供参考。
Willems等[6]通过使用eBURST算法对肠球菌基因组MLST数据进行分析，发现绝大多数感染组分离出来的菌株属于同一簇，称为CC17，然而，这些传染性分离株之间并没有严格的亲缘关系，而且已经相当多样化[7]。在已测序菌株中，溶原噬菌体的多样性是影响粪肠球菌种属多样性的重要原因之一。有研究发现，3个分离株获得一个与esp基因相关的致病岛（Pathogenicity island，PAI），并为该PAI在进化过程中可能发生粪肠球菌水平基因的转移提供了证据。虽然目前粪肠球菌的毒力潜力低于其他球菌，如致病性链球菌和金黄色葡萄球菌，但它对抗生素的耐药性使其成为最难治疗的医院病原体之一。粪肠球菌基因组的灵活性使其能够有效地整合其他基因到粪肠球菌基因库中，从而快速适应新的环境，为马的临床治疗增加了难度[6]。
2.2 ?肠球菌的耐药特征
肠球菌曾一直作为一种可顺利应用抗生素治疗的病原体，但最近几十年多株多重耐药菌株被发现（主要为粪肠球菌和屎肠球菌）。肠球菌细胞壁较厚，耐药性非常复杂，包括天然耐药性、获得性耐药性及耐受性耐药性。其固有耐药性与染色体有关，包括β-内酰胺类、头孢菌素等;而获得性耐药与转座子和质粒有关，包括红霉素、高水平氨基糖苷类等[4]。临床中常根据细菌细胞壁的特征并结合氨基糖苷类药物对肠球菌感染进行联合治疗，但有报道肠球菌对高浓度氨基糖苷类抗生素产生的耐药性增加，且庆大霉素高水平耐药（High-level gentamicin resistance，HLGR）占了较大比例[8]，因此失去了与细胞壁活性抗菌药物的联合作用。同时，作为最后一道防线的万古霉素耐药肠球菌（VRE）分离率在国内亦迅速上升，加大了治疗难度。
2.3 ?肠球菌的致病性研究
肠球菌PAI是细菌染色体上具有特殊结构的基因簇，与细菌毒力及代谢产物等的编码有关。PAIs的存在更有利于细菌的进化，为细菌对不同环境的适应性创造了有利条件[9]。PAIs属于外来性物质，大多通过非固定性元件侵入菌体细胞内，通过各种机理进入细菌染色体的对应位点，此时宿主菌便出现新的致病性特征。这些特征可增加菌体黏附力，有利于其在肠道内易位，耐受能力增强。2002年有学者报道PAI存在于粪肠球菌中[10]，2004年PAI新结构又被Leavis等[11]怀疑存在于屎肠球菌中。PAI主要致病基因如下，细胞溶血素（Cyl）：肠球菌Cyl可溶解红细胞，对血小板及多种细胞存在毒性作用[12];明胶酶E（gelatinase，gelE）：有研究实明gelE及其调节因子fsr参与毒力作用，与肠球菌的炎性作用密切相关[13];表面蛋白（Enterococcal surface protein，Esp）：肠球菌Esp可通过结合子途径在种属间转移，帮助菌株形成生物膜，从而对氨基糖苷类药物产生耐药，Esp基因一直是目前国内外研究的重点;心内膜炎抗原（Endocarditis antigen，EfaA）：不同的种属EfaA基因序列均有明显差异。目前EfaA基因的致病性在粪肠球菌中已被报道，但在其他肠球菌中并未研究出结果;聚集物质（Aggregation substance，AS）：AS基因可引起质粒传递，在躲避宿主免疫反应中作用极大。此外，还有胶原结合蛋白（Adhesin of collagen. from Enterococcus，Ace）和透明质酸酶（Hayluronidase，Hyl）等也是肠球菌毒力因子之一[11]。
2.4 ?马源肠球菌的流行病学分析
马源肠球菌相关报道在国内外均相当匮乏。通过阅读相关文献及查阅相关资料发现，仅有少数国家和地区对该病原菌耐药性及致病性有所研究，耐药基因及毒力基因分子学研究信息资源更是相对缺乏。
2.4.1 ?马源肠球菌耐药性分析 ?2007 年Lleo等[14]曾报道，在不利条件下，肠球菌会处于休眠状态，但仍保留一定的生物学特性，菌株能够从这种状态中复苏并恢复主动感染和抗菌素耐药特性;同年，De 等[15]报道在马匹的临床治疗中有些并没有使用糖苷类药物，却在马身上发现了VRE。然而，Weese等[16]在荷兰马临床样本微生物学诊断中发现肠球菌分离物的百分比从2002年的0上升到2008年的37%;虽然万古霉素一般不用于马科医学，但它有时作为一种治疗替代品具有独特的疗效，因此vanA-enterococci的存在就成为一个严重的临床问题[17]。2008年，Laukova等[18]发现，耐万古霉素肠球菌在马场分离株中比例高达 37.2%，但万古霉素耐药基因检测为阴性。从健康和患病的马的粪便中分离出的肠球菌对抗生素的耐药性已经在先前研究中得到了评估并被报道[19];2010 年，葡萄牙学者研究发现，可以在粪便中检测出vanA-enterococci，并可能会传播给其他动物的耐药细菌宿主，耐药决定因素和耐药细菌可以在局部地区和全球范围内轻松传播，从而增强耐药性的出现[20]。
2.4.2 ?马源肠球菌致病性分析 ?2007年，Lleo等[14]报道曾有一匹小马因感染粪肠球菌而发病，粪肠球菌还能形成生物膜，以避开宿主的防御，增加治疗难度;2009年，美国科学家曾报道某骑师因铅黄肠球菌入侵而患眼内炎[21];2010年，Taylor等[22]报道在9%的肌肉骨骼败血症病例中分离出肠球菌;2012 年，Herdan等[23]首次报道新西兰有3匹外伤马匹由于继发感染多重耐药性肠球菌而引起滑膜败血症;2013年，部分韩国学者对100多家马术俱乐部进行马源肠球菌特征分析，通过抗微生物（AR）图谱显示：AR肠球菌的平均比例为23.8%，分别在51.1%和47.7%的分离株中观察到生物膜的形成和凝胶酶的活性;大多数是携带gelE基因的粪肠球菌，提供了AR肠球菌在马及其环境之间传播的证据，强调了AR肠球菌通过密切接触传播给骑手和操作者的风险，并阐明了AR肠球菌向人类传播的风险[24]。2017 年，有学者对新疆马的人畜共患病进行流行病学调查，结果显示，马源粪肠球菌的阳性率约为15%，毒力基因检出率为40%～80%，给当地经济造成了一定的潜在性威胁[25]。有研究显示，致病菌株往往具有多重耐药性，并表现出溶血、细胞外明胶酶和胶原蛋白黏附等毒力因子，且肠球菌株耐药的严重性直接影响其致病性[26]。
3 ?研究结果
通过查阅相关文献并进行分析总结得出以下结果：①马源肠球菌耐药及致病研究资料相当匮乏;②马源肠球菌耐药性及致病性日益严重，对马产业发展存在一定的潜在威胁性，应引起学者的高度重视。
4 ?对策及分析
4.1 ?马源肠球菌的遗传特性
分离培养主要肠球菌，采用全基因组抽取法进行全基因组DNA提取，通过1.2%（W/V）琼脂糖凝胶电泳对基因组DNA浓度进行估测，并用Biodrop进行定量。其纯度和浓度都达到测序要求后进行全基因组测序。采用各种相关软件对不同地区、不同株的肠球菌进行基因组差异和进化关系等研究，分析不同来源的菌株在进化树上的特征。应用脉冲场凝胶电泳（PFGE）和多位点序列分型（MLST）技术进行遗传背景研究，寻找病原菌及耐药菌株在进化上的地位，为以后病原菌感染和致病机制研究工作提供参考。该方法可系统性地从分子水平对武汉市各地马匹进行肠球菌遗传特性分析，比较不同环境对肠球菌进化的影响，从而为马源肠球菌的耐药及致病机理研究提供参考。
4.2 ?马源肠球菌耐药特性
对肠球菌主要抗生素进行耐药表型检测，对鉴定出的肠球菌采用微量肉汤稀释法测定最小抑菌浓度（MIC），并统计分析其耐药情况;对耐药菌株进行耐药基因检测（主要为氨基糖苷类药物和万古霉素），统计分析耐药基因与耐药表型的相关性;由于HLGR及VRE的分离率在国内迅速上升，故可对临床中马源HLGR、VRE菌株耐药表型、耐药基因和耐药传播机制进行研究，为HLGR、VRE感染的防治提供基础。该方法可从基因学层面对马源肠球菌主要抗生素即氨基糖苷類和万古霉素耐药的生物学特性及遗传背景进行探索，有利于控制耐药基因的传播，降低马产业经济因肠球菌抗生素严重耐药导致的损失。
4.3 ?马源肠球菌毒力特性
粪肠球菌致病岛是由许多毒力基因组成的基因簇，是肠球菌致病的来源，因此可对各毒力基因分布特征进行研究，从而为以后致病性肠球菌的研究打下基础。
胶原结合蛋白ace是肠球菌表面识别黏附基质的一类蛋白分子，它能介导肠球菌黏附在宿主细胞的外基质蛋白之上，是肠球菌重要致病因子之一。然而目前对马源肠球菌的研究并不多，尤其毒力因子ace的研究更少。为研究ace基因对肠球菌的致病性影响情况，可选取武汉市马源肠球菌为研究对象，构建肠球菌ace基因突变菌株，研究ace基因在肠球菌感染中的分子机制，探讨ace基因在菌体致病表达中的作用，为马临床肠球菌致病机制的研究等提供理论基础。
4.4 ?制订马匹用药指南
最后，根据其耐药及致病结果筛选出马匹最佳用药方案，制订合理的马匹用药指南，从而减少因滥用抗生素而增加临床中马匹治疗难度的困扰。该内容为保证竞赛马匹健康提供了一定的理论基础，同时也为顺利完成第七届世界军人运动会马术赛事提供了一定的服务保障。
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