基于全基因组重测序构建西瓜高密度遗传 图谱和果实相关性状的基因定位

    李兵兵 路绪强 豆峻岭 高磊 赵胜杰 何楠 刘文革

    

    目的与意义：遗传图谱是进行重要农艺性状QTL/基因定位、图位克隆、分子标记辅助育种等工作的重要工具。长期的人工选择使得栽培种西瓜的遗传基础进一步狭窄，使得高效可获得的分子标记成为限制西瓜高密度遗传图谱构建的重要因素。随着高通量测序技术的发展和西瓜参考基因组草图的组装完成，通过测序获得大量分子标记以构建高密遗传图谱成为可能。通过全基因重测序构建高密度遗传图谱，可以更快更准确的检测重组断点，开发大量适于遗传图谱构建的分子标记。最近几年，陆续有多张西瓜遗传图谱发表。但这些图谱大都基于简化基因组测序，遗传图谱的饱和度相对不足;作图群体多为临时性分离群体，不能进行重复试验，影响后续基因定位工作的准确性。笔者构建了重组自交系作为永久性作图群体，通过对其进行全基因组重测序构建了一张西瓜高密度遗传图谱，并对果皮颜色、种皮颜色和果实苦味3个性状进行了初定位，以期用于西瓜分子遗传育种等工作。

    材料与方法：以具有显著性状差异的自交系材料‘9904和‘Handel为亲本，经过连续7代自交，构建了含126个单株的重组自交系。‘9904具有墨绿色果皮、浅黄色种皮、苦味果实; ‘Handel具有浅绿色果皮、黑色种皮、无苦味果实。采集西瓜植株幼嫩叶片，提取植物基因组DNA，质量检测合格的DNA将用于测序建库。高质量的DNA被随机打断为200～500 bp的片段，然后经过DNA片段末端修复、3端加A、添加测序接头和进行纯化、最后经PCR扩增等完成测序文库的构建。文库经严格的质量检测后通过Illumina HiSeqTM测序平台进行测序。完成标记的填补和校正后，根据子代重组情况进行bin划分。将各样本按照染色体物理位置排列整齐，当任何样本出现分型转变时认为出现重组断点，然后将重组断点间的SNP化为一个bin中。同时对bin进行偏分离过滤，对严重偏分离的标记进行过滤（P<0.001）。长度小于20 kb以下的bin被筛除，过滤掉非染色体上的bin，最后以bin为作图标记进行遗传图谱的构建。使用MapQTL软件结合重组自交系的表型对果皮底色、种皮颜色和果实苦味进行连锁分析。

    结果与分析：（1）通过对RIL群体和亲本进行重测序，分别得到177.08 Gbp、7.67 Gbp和8.81Gbp的高质量数据。Q30超过85%，CG的平均含量接近35%。‘9904‘Handel和重组自交系群体测序的平均覆盖深度为17 X、19 X和2.99 X。亲本基因组平均覆盖度均在99.42%以上，重组自交系平均覆盖度在89.28%以上。基因組基本被覆盖，整体分布均匀，说明测序的整体随机性较好。（2）构建的西瓜高密度遗传图谱包含11条连锁群，由2 132个重组bin标记组成，上图SNP有103 029个，图谱总长度1508.94 cM，平均图距为0.74 cM（原图2）。（3）共定位到3个显著性位点（原图6）：在1号染色体上定位到一个与果实苦味有关的位点qbt-c1-1，LOD值为58.361，位于Block876-Block1188之间，区间范围为0-45.91 cM，解释表型变异为82.927%。在3号染色体上定位到一个与种皮颜色有关的位点qrc-c3-1， LOD值为26.852， 位于Block3708-Block3722之间，区间范围为31.705-32.505 cM，解释表型变异为58.685%。在8号染色体上定位到一个与果皮颜色有关的位点qrc-c8-1， LOD值为18.353，位于Block8000-Block8110之间，区间范围为142.728-154.742 cM，解释表型变异为49.9425%。

    结? ? 论：本研究构建了一张西瓜高密度遗传图谱，并对果皮颜色、种皮颜色和果实苦味等果实相关性状进行了初定位分析，为果皮颜色、种皮颜色和果实苦味候选基因的精细定位及阐明其形成的分子机理等奠定了基础，同时为西瓜分子标记辅助育种的提供了工具。