FQ—PCR在我国猪病诊断中的应用

    余天鹏

    摘要：分析了FQ-PCR方法的原理、分类、与常规病原检測方法相比的优缺点及其在猪重大病毒性疫病检测上的应用等，供参考。

    关键词：FQ-PCR；养猪业；应用

    中图分类号：S858.28 文献标识码：B 文章编号：1007-273X（2017）11-0029-02

    近年来，我国养猪业发展迅速，粗放式的散养模式已不能适应现代社会发展的需求，2013和2014年大量散养户陆续退出。未来5至10年将进入我国生猪产业发展的黄金时期，猪肉制品的刚性需求决定生猪产业具有广阔的发展空间，在我国猪肉占国民肉类制品需求的60%以上。然而我国生猪发展的规模化和集约化地区发展极不平衡，在环境保护、品种选育、动物福利、科学与自动化管理、疾病控制、合理用药、食品安全领域严重落后于发达国家水平。FQ-PCR是在传统PCR基础上加入信号系统达到实时监测PCR扩增的目的，继承了传统PCR高灵敏度和操作简便的特点，同时实现了对样本的定量检测。其具有灵敏度高、重复性好、特异性强、线性范围广、过程速度快、全封闭反应等优点。

    1 FQ-PCR概述

    FQ-PCR的原理是在常规 PCR反应体系中加入荧光基团，反应过程中荧光信号随核酸产物的增加而等比加强，根据实时荧光信号强度监测核酸产物量的变化，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析。荧光定量PCR技术采用了Ct值这一重要概念，即每个反应管内的荧光信号达到所设定的阈值所经历的循环数，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小，根据已知起始拷贝数的标准品做标准曲线，测出未知样品的Ct值即可通过标准曲线算出其起始拷贝数。

    FQ-PCR融合了常规PCR技术与DNA探针杂交技术的优点，整个试验过程只在加样时打开1次反应管，在PCR的每个循环中通过监测荧光信号的变化来反映DNA链扩增结果的变化，并通过计算机软件进行定量。FQ-PCR简便快速，灵敏度最高，可定量，抗污染能力强，但其成本稍高。

    2 FQ-PCR分类

    荧光定量标记方法大致可分为两大类：特异荧光标记法和非特异性荧光标记法。特异性荧光标记法主要通过荧光探针和引物探针来进行标记， 主要包含 Taqman探针法、双杂交探针和分子信标；非特异性荧光标记法通过在双链DNA内插式荧光染料来标记。

    3 FQ-PCR技术在猪病毒性疾病诊断中的应用

    随着生猪规模化养殖的快速发展，猪传染性疾病不断增多，给养猪业带来了极大的损失。猪瘟、猪伪狂犬病、猪圆环病毒病、猪繁殖与呼吸综合征、流行性腹泻和传染性胃肠炎等几种常发疾病严重威胁着养猪业的健康发展，快速、准确的对病原体进行定性定量的检测变得尤为重要。

    赵建军等[1]应用猪瘟病毒通用引物和野毒特异性 TaqMan探针建立了荧光定量PCR方法，可检测到初始模板中10拷贝/μL的病毒核酸，与RT-套式PCR具有相近的敏感性。Balka等[2]建立了猪繁殖与呼吸综合症病毒的一步实时荧光定量RT-PCR检测方法，该方法可鉴别诊断PRRSV的所有基因型，适用于检测和定量所有的猪繁殖与呼吸综合症病毒株。危艳武等[3]建立了检测PCV2的SYBR-Green荧光定量PCR方法。该方法具有很好的线性关系，对质粒标准品检测的下限值小于10拷贝/μL。赵丽等[4]根据PRV病毒gH、gE基因的序列设计引物，建立了鉴别PRV野毒与疫苗毒感染的TaqMan探针荧光定量PCR方法。该方法对60份疑似组织样品进行检测，并与血清中和试验、常规PCR相比较，该方法具有快速、灵敏、特异、重复性好和能对样品进行定量检测等优点。Kim等[5]根据猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）和猪流行性腹泻病毒（PEDV）特异性核酸序列分别设计引物与探针，建立鉴别诊断TGEV和PEDV的双重荧光定量 RT-PCR 诊断方法，为诊断和定量化 TGEV 和PEDV 提供了一种特异、敏感的诊断方法，为农场中猪病的有效控制提供了技术支持。

    参考文献：

    [1] 赵建军，成 丹，李 娜，等.猪瘟病毒实时荧光定量RT-PCR的建立及其对人工感染猪体内猪瘟病毒的检测[J].畜牧兽医学报，2007：38（7）：685-693.

    [2] BALKA G，HORNYAK A，BALINT A， et al. Development of a one-step real-time quantitative PCR assay based on primer-probe energy transfer for the detection of porcine reproductive and respiratory syndrome virus[J].J Virol Methods，2009，158（1-2）：41-45.

    [3] 危艳武，刘长明，袁 婧，等.实时定量PCR对猪圆环病毒2型感染猪体内病毒分布规律的研究[J].中国预防兽医学报，2008，30（12）：924-928.

    [4] 赵 丽，崔保安，陈红英，等.鉴别伪狂犬病病毒野毒与疫苗毒荧光定量PCR方法的建立[J].生物工程学报，2008，24（7）：1149-1154.

    [5] KIM S H，KIM I J，PYO H M，et al. Multiplex real-time RT-PCR for the simultaneous detection and quantification of transmissible gastroenteritis virus and porcine epidemic diarrhea virus[J].J Virol Methods，2007，146（1-2）：172-177.