基于金属有机多面体的可视化检测方法的构建及应用

    卢朝粉　张菊梅　秦渝　郑立炎　曹秋娥　周川华

    

    

    

    摘 要 结合金属有机多面体的高催化活性和抗坏血酸的还原性建立了一种简单、高灵敏的抗坏血酸（AA）可视化检测方法。采用铜离子-有机多面体纳米棒（Copper metal-organic polyhedra nanorods，Cu-MOP）作为类辣根过氧化物酶，在H2O2存在下，Cu-MOP催化氧化3，3′，5，5′-四甲基联苯胺（TMB），检测液中存在的AA使Cu-MOP中的Cu2+还原，类辣根过氧化物酶催化活性大大降低，抑制Cu-MOP对TMB的催化氧化，因此，可以利用检测液颜色及其吸光度实现对AA的特异性检测。AA的浓度在1.0～30.0 μmol/L及40.0～200 μmol/L范围内与体系452 nm的吸光度（A452 nm）呈线性关系，检出限（S/N=3）为0.68 μmol/L。本方法简单、快速、无需复杂仪器，将其应用于药品中AA的测定，结果令人满意。

    关键词 铜离子-有机多面体纳米棒; 3，3′，5，5′-四甲基联苯胺; 抗坏血酸; 可视化检测

    1 引 言

    天然酶是由生物体活细胞所产生的具有特异性催化功能的蛋白质。但是天然酶存在成本高、易失活、储存条件严格等缺点，在一定程度上限制了它们的应用[1，2]。纳米酶因低成本、高稳定性及好的催化活性逐渐受到关注[3]，其开发和应用逐渐成为相关研究热点。近年的研究发现，很多纳米材料（如纳米金[4]、碳点[5]、碳纳米管[6]、石墨烯[7]、磁性纳米颗粒[8]等）都具有类辣根过氧化物酶活性。但是，这些材料多需在酸性条件下合成[9，10]，其催化活性也有待进一步提高，在一定程度上限制了其在生物医学等方面的应用。因此，寻找催化活性更高，而且可在更宽的pH范围内使用的纳米模拟酶是当前的研究热点。

    金属有机多面体（Metal-organic polyhedra， MOP）是通过金属离子和有机配体进行自组装而形成的一类离散分子笼形结构，具有内部空腔[11，12]，可通过选择不同的金属离子和有机配体调控其结构、形态及大小[13]，具有孔隙率高、比表面积大[14]和化学可调控性等特点，因其具有高度的对称性和稳定性、丰富的物理化学性质[15]，以及在吸附[16]、催化[13，17]、药物释放[18]、分子封装[19]等方面的潜在应用而受到了广泛关注。前期工作中，本研究组合成出具有类辣根过氧化物酶活性的Cu-MOP纳米棒[20]，该材料可在中性甚至偏碱性的条件下保持非常高的催化活性，将其应用于血清中葡萄糖的高灵敏检测，检出限低至1.5×10Symbolm@@6 mol/L。

    抗坏血酸（AA）即维生素C，是人体重要的微量营养素之一，可用于预防和治疗普通感冒、不孕症、精神疾病[21]、癌症和获得性免疫缺陷综合征[22]等。当人体缺乏AA时，会导致脓毒症[23]、坏血病[24]、动脉粥样硬化[25]、白内障坏死和肝脏疾病等[26]。因此，建立简单、准确、快速检测AA的分析方法具有重要的意义。本研究采用Cu-MOP纳米棒作为类辣根过氧化物酶，将其与AA的还原性相结合，建立一种快速、简单、无需复杂仪器的方法检测AA。将本方法用于维生素C片中AA的检测，为AA的可视化检测提供了新思路。

    2 实验部分

    2.1 仪器与试剂

    UV-3600plus紫外-可见分光光度计（日本Shimadzu公司）; SU3500扫描电子显微镜（日本日立公司）; K-Alpha+型X-射线光电子能谱仪（美国Thermo Fisher Scientific公司）; KQ-218超声波清洗仪（深圳洁盟清洗设备有限公司）; SYG-2恒温水浴锅（常州朗越仪器制造有限公司）; FA32精密分析天平（豪斯仪器（上海）有限公司）; PB-10 pH计（德国Sartorius公司）。

    AA、K2S2O8（Adamas试剂有限公司）; 葡萄糖、无水乙醇、NaAc·3H2O、冰乙酸、CuSO4·5H2O、Na2SO4、KNO3、甘油、淀粉）、硬脂酸镁（MS）、甲基纤维素（MC）、SiO2（国药集团化学试剂有限公司）; 四甲基联苯胺（TMB）、H2O2（质量分数30%）（美国Sigma-Aldrich公司）。其它试剂均为分析纯，实验用水为超纯水（电阻率为18.25 MΩ cm，美国Millipore公司Milli-Q超纯水仪制备）。

    2.2 Cu-MOP的合成

    参照文献[20]的方法合成Cu-MOP。首先配制0.2 mmol/L 5-溴-1，3-苯二羧酸和0.2 mmol/L CuSO4的混合物，溶于5 mL 甲醇-二甲基甲酰胺（4∶1， V/V）中， 75℃反应48 h，冷却至室温，产物用甲醇冲洗。得到的Cu-MOP在水中浸泡48 h，然后冷冻干燥，得到Cu-MOP纳米棒。

    2.3 AA的检测

    将60 μL不同浓度的AA加入到60 μL含有20 μg/mL Cu-MOP的0.1 mol/L NaAc-HAc缓冲溶液（pH 7.0）中，再加入20 μL 10 mmol/L TMB乙醇溶液和20 μL 0.6 mol/L H2O2溶液，混匀，在25℃恒温水浴中反应8 min。加入20 μL 3 mol/L HCl，混匀，测定溶液在350～550 nm的吸收光谱，观察检测液的颜色并拍照。

    2.4 实际样品分析

    维生素C片购于本地药店，其中样品1规格为650 mg/片，样品2规格为1200 mg/片。

    将两种维生素C片研磨， 各称取0.1000 g，用10.0 mL 0.1 mol/L NaAc-HAc缓冲溶液（pH 7.0）溶解，以10000 r/min离心1 min，取300 μL樣品1的上清液，稀释至1000 μL，按照2.3节所述方法进行测定。另取100 μL样品2的上清液，稀释30倍，按照2.3节所述方法进行测定，并进行加标回收实验。

    3 結果与讨论

    3.1 基于Cu-MOP可视化检测抗坏血酸的原理

    检测原理如图1所示。所制备的Cu-MOP具有良好的类过氧化物酶活性，在H2O2存在的条件下，

    可快速将TMB氧化为TMB+，加入HCl后，变成黄色的TMB2+[27，28]。当待测液中含有AA时，由于Cu-MOP中的Cu2+被还原[29]，Cu-MOP的结构被破坏，其催化TMB氧化的能力大大降低; 另一方面，AA还可将氧化态TMB还原，因此，检测液中TMB2+的含量大大减少。

    利用检测液的颜色及其在452 nm处的吸光度的变化可实现对AA的可视化以及定量检测。

    3.2 方法的可行性

    如图2所示，当反应液中不存在Cu-MOP时，单独的H2O2不能氧化TMB，溶液仍为无色，在452 nm处几乎没有吸收（曲线c）; 当向含有TMB和H2O2的溶液中加入Cu-MOP，并孵育8 min后，检测液变为黄色，且其在452 nm处的吸光度显著增加，表明Cu-MOP催化H2O2对TMB的氧化（曲线a）; 而向含有AA的待测液中分别加入Cu-MOP、H2O2及TMB，并孵育8 min后，检测液为浅黄色，452 nm处的吸光度较小（曲线b），表明AA可明显抑制Cu-MOP-H2O2-TMB体系的催化氧化反应。

    采用扫描电镜（SEM）及X-射线光电子能谱（XPS）对与AA反应前后的Cu-MOP进行表征。如图3所示，合成的Cu-MOP呈棒状（图3A），含有Cu、C、O、Br等元素（图3B）; Cu（2p）在934.36 eV处有一个明显的峰，并且在此峰左侧有两个明显的卫星峰（图3C）; 说明Cu-MOP中的铜为Cu2+。当0.1 mmol/L AA与Cu-MOP在0.1 mol/L NaAc-HAc缓冲溶液（pH 7.0）中反应后，Cu-MOP的结构基本被破坏（图3D）; 由XPS图中可看出， Cu（2p）所在峰的强度明显下降（图3E）; 由图3F中窄谱可看出，Cu（2p）峰（934.7 eV）左侧未出现卫星峰，表明Cu-MOP中的Cu2+被还原，使Cu-MOP的类过氧化物酶催化活性大大降低。因此，可利用AA对Cu-MOP-H2O2-TMB体系的抑制实现对AA的检测。

    3.3 检测条件的优化

    检测液的pH值对Cu-MOP催化反应和AA与Cu-MOP的反应都会产生影响。固定其它反应条件，改变检测液的pH值，比较有无AA时，检测液在452 nm处的吸光度（A452 nm）。 如图4A所示， Cu-MOP在中性偏碱性条件下具有较好的催化能力，虽然Cu-MOP对TMB-H2O2体系的催化能力在pH 7.5时最大，但在加入AA后，pH 7.0时抑制效果最好，故选择pH 7.0为检测液的最佳pH值。

    考察了Cu-MOP的浓度对TMB-H2O2催化反应的影响，结果如图4B所示，随着检测液中Cu-MOP浓度增加，检测液A452 nm值逐渐增大，为了使紫外-可见吸收光谱测量的相对误差较小，选择60 μg/mL Cu-MOP进行催化反应。作为Cu-MOP的底物，检测液中H2O2的浓度增加，会使其催化反应加速，当H2O2浓度大于60 mmol/L时，检测液A452 nm趋于稳定（图4C），因此， 选择H2O2的浓度为60 mmol/L。如图4D所示，A452 nm随TMB浓度的增加而增大，当TMB的浓度大于1 mmol/L时趋于平衡，因此选择TMB的浓度为1 mmol/L。

    3.4 方法的分析性能

    在最佳反应条件下，对不同浓度的AA进行检测，结果如图5所示。随着AA浓度增加，Cu-MOP的类过氧化物酶催化活性逐渐被抑制，检测液的颜色由黄色逐渐变为无色（图5A），检测液中TMB2+在452 nm处的吸光度逐渐下降（图5B），A452 nm与AA的浓度在1.0～30.0 μmol/L及40.0～200 μmol/L之间呈线性关系（R2分别为0.994和0.991）。当AA浓度较低时，可能由于Cu-MOP中只有部分Cu2+与AA发生反应，对Cu-MOP的结构破坏作用有限，所以抑制作用相对较小; 当AA的浓度大于40.0 μmol/L时，Cu-MOP的结构被破坏程度很大（图3D），Cu-MOP的催化活性被大大抑制，所以标准曲线斜率相对较大。本方法的检出限为0.68 μmol/L（S/N=3）。与文献中报道的AA检测方法相比[30～35]，本方法具有更低的检出限和较宽的线性范围（表1）。

    3.5 方法的选择性

    考察了方法的选择性。以维生素C片中几种常见的辅料（如淀粉（Starch）、硬脂酸镁（MS）、葡萄糖（Glucose）、甘油（Glycerol）、SiO2、甲基纤维素（MC）等）作为干扰物质，采用本方法进行检测，结果如图6所示，10倍浓度于AA的常见辅料并未干扰AA的测定结果，表明本方法对AA检测具有良好的选择性。

    3.6 实际样品分析

    为了考察本方法的实用性，对维生素C药片中AA的含量进行了测定，检测结果如表2所示，样品的加标回收率在92.0%～105.0%之间，相对标准偏差小于5.0%，表明本方法可用于实际样品中AA的测定。

    4 结 论

    结合Cu-MOP良好的类辣根过氧化物酶催化活性和AA的还原性，建立了一种基于MOP的AA可视化检测方法。结果表明，AA可破坏Cu-MOP的结构，抑制其类辣根过氧化物酶催化活性，据此可实现对AA的特异性检测。本方法快速、简单， 无需复杂仪器，被成功应用于药片中AA的测定。

    References

    1 Lin Y H， Ren J S， Qu X G.? Acc. Chem. Res.， 2014， 47： 1097-1105

    24 Mu C L， Lu H F， Bao J， Zhang Q L.? Spectrochim. Acta A， 2018，? 201： 61-66

    25 Wahlberg G， Walldius G.? Atherosclerosis， 1982，? 43： 283-288

    26 Hadzpetrushev N， Dimovska K， Jankulovski N， Mitrov D， Mladenov M.? Adv. Pharm. Sci.， 2018，? 2018： 1-7

    27 Wang S Q， Deng W F， Yang L， Tan Y M，Xie Q J， Yao S Z.? ACS Appl. Mater. Interfaces， 2017，? 9（29）： 24440-24445

    28 Yao D M， Li C N， LiangA H， Jiang Z L.? Spectrochim. Acta A， 2019，? 216： 146-153

    29 Feng J， Ju Y Y， Liu J J， Zhang H G， Chen X G.? Anal. Chim. Acta， 2015，? 854： 153-160

    30 Darabdhara G， Sharma B， Das M R， Boukherroub R， Szunerits S.? Sens. Actuators B， 2017，? 238： 842-851

    31 Selvarajan S， Suganthi A， Rajarajan M.? Surf. Rev. Lett.， 2017，? 7： 146-156

    32 Mohammad A W， Farzana D， Nazrul I， David J Y.? Molecules， 2018，? 23（2）： 234

    33 Li Q， Huo C R， Yi K， Zhou L L， Su L， Hou X M.? Sens. Actuators B， 2018，? 260： 346-356

    34 Chen P P， Yan S X， Sawyer E， Ying B W， Wei X W， Wu Z Z， Geng J.? Analyst， 2019，? 144： 1147-1152

    35 ZI Qin-Jiang， WANG Jing， CAO Qiu-E， ZHOU Chuan-Hua.? Chinese J. Anal. Chem.， 2018，? 46（8）： 1215-1221

    字琴江， 王 瑾， 曹秋娥， 周川華. 分析化学， 2018，? 46（8）： 1215-1221

    Construction and Application of Metal-Organic

    Polyhedra-based Colorimetric Assay

    LU Chao-Fen， ZHANG Ju-Mei， QIN Yu， ZHENG Li-Yan， CAO Qiu-E， ZHOU Chuan-Hua*

    （School of Chemical Science and Technology， Experiment Centre of Chemistry and Chemical Engineering，

    Functional Molecules Analysis and Biotransformation Key Laboratory of Universities in Yunnan Province，

    Yunnan University， Kunming 650091， China）

    Abstract A simple and highly sensitive colorimetric assay method for ascorbic acid （AA） detection was developed based on the high catalytic activity of metal-organic polyhedron （MOP） and the reducibility of ascorbic acid. Copper metal-organic polyhedra nanorods （Cu-MOP） exhibited high peroxidase-mimicking activity， which were capable of catalyzing the oxidation of the 3，3′，5，5′-tetramethylbenzidine （TMB） in the presence of H2O2. The presence of AA in detection solution triggered the decomposition of Cu-MOP by reducing Cu2+， which weakened peroxidase-mimicking activity of Cu-MOP dramatically. As a result， the catalytic oxidation reaction of TMB by Cu-MOP in the presence of H2O2 was inhibited， and AA could be detected specifically by detecting the solution color and its absorbance. The calibration graph for the determination of AA was linear in the range of 1.0-30.0 μmol/L and 40.0-200 μmol/L， and the detection limit （S/N=3） was 0.68 μmol/L. The sensor showed many advantage such as simple， fast and without the need of complicated instruments， and could be applied to the determination of AA in drugs with satisfactory results.

    Keywords Copper metal-organic polyhedra nanorods; 3，3′，5，5′-Tetramethylbenzidine; Ascorbic acid; Colorimetric assay

    （Received 23 October 2019; accepted 28 May 2020）

    This work was supported by the National Natural Science Foundation of China （Nos. 21505119， 21465025）.

    2019-10-23 收稿;? 2020-05-28 接受

    本文系国家自然科学基金项目（ Nos. 21505119， 21465025）资助

    * E-mail： chzhou@ynu.edu.cn