白楠大小孢子发生与雌雄配子体的发育观察
邓金胜+张建+况红玲+张欣+喻峰+杜丹+王昆
摘要：白楠为樟科楠属植物，是优秀的生态树种和珍贵的用材树种，具有很高的价值。本文采用石蜡切片法对白楠（Phoebeneurantha）的胚胎发育过程进行了研究。主要内容包括白楠大、小孢子发生，雌、雄配子体的发育以及开花后子房发育的研究。主要研究结果表明，白楠的子房为一室，双珠被，厚珠心，多单胚珠，少数双胚珠，倒生。胚囊发育类型为蓼型胚囊，与樟科其他属种一致，大孢子母细胞经过减数分裂形成直线排列的四个大孢子，其中三个靠近珠孔端的大孢子相继退化死亡，而合点端的大孢子则发育成为功能大孢子，形成单核胚囊，经过三次分裂，形成八核七细胞的成熟胚囊。雄蕊花药为四室，花药壁自外向内分别为表皮、药室内壁、中层和绒毡层，随着花药的进一步发育，药室内壁和绒毡层逐渐解体消失，成熟花粉为二细胞型花粉，绒毡层类型为变形绒毡层。小孢子有部分败育现象，这可能是由于绒毡层不能及时降解，导致小孢子无法吸收营养，从而导致败育。
关键词：白楠；大、小孢子发生；雌、雄配子体发育；败育
中图分类号：Q132文献标识码：A文章编号：1004-3020（2017）06-0006-06TheMegasporogenesis，
Microsporogenesis，FemaleandMaleGametophyteDevelopmentofPhoebeneuranthaDengJinsheng（1）ZhangJian（2）FangHongling（1）ZhangXin（1）YuFeng（1）DuDan（1）WangKun（1）
（1.FayeEcologicalEnvironmentGroupCo.，LTDWuhan430206；2.YangtzeUniversityJingzhou434100）Abstract：PhoebeneuranthaisexcellentecologicalspeciesandraretreespeciesofLauraceaePhoebenees，hasaveryhighvalue.MethodofusingparaffinPhoebeneuranthatostudytheprocessofembryonicdevelopment.Maincontentsincludethemegasporogenesis，microsporogenesis，developmentofmaleandfemalegametophyteandstudyonovarydevelopmentafterflowering.MainresultsshowthattheovaryofPhoebeneuranthahad1-locules，doubleintegyment，thicknucellus，singleovule，afewpairofovules，ovuleswasanatropous.Embryosacdevelopmenttypeforpolygonumtype，andLauraceaeotherisspeciesconsistent，themegasporesmothercellformedalineartetradof4megasporesaftermeiosis.Thechalazalmegasporedevelopedthefunctionaloneandotherthreeatthemicropylarpoleweredegraded.Formedsinglenuclearembryosac，afterthreetimessplit，formedeightnuclearsevencellofmatureembryosac.Therewrer4loculesanthersacinflowers，Thewallofflowersisconsistofepiderment，endothecaendothecium，middlelamellaandtapetum.Alongwiththefurtherdevelopmentoftheanther，endotheciumanddisintegrationoftapetalcellsgraduallydisappear，maturepollengrainswere2-celledtypes.Thetapetumwasamoeboid.Therewerelittlepollenabortionandmalesterilitysincethetapetumofmalesterileplantsdelayeddegradationandthemicrosporescouldnotobtainenoughnutritionfornormaldevelopment.
Keywords：Phoebeneurantha；megasporogenesisandmicrosporogenesis；maleandfemalegametophytesdevelopment；abortion
白楠是樟科楠屬植物，为多年生大灌木至乔木，通常高3～14m；树皮灰黑色。小枝刚开始有较短柔毛或是长柔毛，柔毛会随着发育逐渐消失。叶为革质叶，狭披针形、披针形或倒披针形，长80～160cm，宽15～40cm，叶片先端尾状渐尖，基部渐狭下延，极少为楔形，叶片上面无毛或嫩时有毛，下面为绿色或苍白色，叶片嫩时有或多或少的灰白色柔毛，后来会逐渐变为散生柔毛或是无毛，叶脉的中脉下陷，叶片两边分别有侧脉8～12条，且有着较明显的横脉和小脉；叶柄长7～15mm，被柔毛或近于无毛。白楠为圆锥花序，花长4～5mm，花梗被毛，长3～5mm；花被片为卵状，外轮的花被较短且狭窄，内轮与之相反，长且宽，花被片先端不尖，较钝，内面毛特别密集；每轮花丝上有较长柔毛，花内腺体没有柄，着生在第三轮花丝的基部，退化后的雄蕊有柄，且有较长柔毛；子房球形，花柱伸长，柱头盘状。果实为卵形，长度为1mm，宽度为7mm；在生长发育时果梗会略微变粗；宿存的花被片为革质，排列较松散，花被片的先端有时会向外倾斜，具有明显的纵脉。花期5月，果期8～10月[1]。
白楠为耐阴树种，适合生长在气候温暖湿润的地方，对土质的要求为较疏松且排水较良好的土地，尤其是在中性或偏酸性的壤质土地上，生长得非常良好，白楠的根部有着很强的萌发力，能短期耐涝。寿命较长，较抗虫，能长成大径材[2]。主要生长在山地密林中，产于我国的湖北、江西、四川、云南、贵州等地。
白楠是珍贵的用材树种。木材颜色为黄褐色，与樟科植物一样具有芳香味。且木材的构造较细，硬度较强，密度不大，不容易受到挤压变形，耐腐蚀不容易被虫蛀。木材易加工，经过稍微加工木材纹理就会变得光滑美观，是用来做家具、雕刻和建筑的非常好的材料。也是用来制作紧密仪器和造船材料的不二选择[3]。且树形优美，枝繁叶茂，生长非常迅速，是极佳的庭荫树种和绿化树种。同时白楠也是亚热带常绿阔叶林中及其重要的伴生树种，有着非常强大的生态调节功能。所以发掘和使用白楠这一珍贵树种资源具有重要意义[4]。
湖北林业科技第46卷第6期邓金胜，等：白楠大小孢子发生与雌雄配子体的发育观察楠木向来有“木中金子”之称，其材质通直圆满、纹理美观、结构细致、质韧难朽、奇香不衰，用途十分广泛，为江南四大名木之冠。由于楠木巨大的经济价值和广泛的用途，导致其野生资源被破坏得极其严重，目前已难觅天然楠木林，许多楠属植物沦为濒危或渐危树种[5]。根据《中国植物红皮书—稀有濒危植物名录》（第一册）和1999年国务院批准发布的《国家重点保护野生植物名录》（第一批），楠属的楠木（Phoebezhennan）、闽楠（P.boumei）、浙江楠（P.chekiangensis）、滇楠（P.nanmu）等均为濒危种，为国家Ⅱ级保护植物[6-7]。要保护楠木资源，首要任务是要为其提供较强的繁殖能力。从繁殖的角度来看，种子植物有性生殖过程大致可分为4个阶段：雌雄配子的发育、传粉与受精、胚发育和
果实（种子）成熟、成熟种子散步与萌发[8]。
而目前对于楠木各个树种的研究报道很少，无法对其生殖生育的整个过程形成一个系统的认识，对于白楠的研究几乎没有。本研究在前人的研究基础上，对白楠花发育过程中，大、小孢子发生及雌、雄配子体的形成进行了详细的细胞学观察和研究，旨在为该种资源保护、良种繁殖和系统进化研究提供生殖生物学方面的基础资料。
1材料与方法
1.1实验材料
本研究采用的实验材料来自长江大学盆景园内的白楠树。从它的花期开始，每隔3d采集一次，采集不同时期的白楠花，取材料时用高枝剪剪下。采集材料之后用70%FAA溶液进行固定。70%FAA溶液由5mL甲醛、冰5mL乙酸和90mL70%乙醇组成。
1.2实验方法
1.2.1常规石蜡切片法的制片过程
（1）材料固定：将小花投入装有FAA固定液（20倍材料）中的青霉素小瓶，用真空抽气泵缓慢抽去花芽中的气泡，等到花芽沉入瓶底后，停止抽气，更换FAA固定液。放入4℃冰箱，固定4h以上。
（2）脱水：抽气完成后，将花芽从FAA中取出，依次通过50%、70%、85%、95%、100%浓度的酒精浸泡润洗，每个浓度浸泡2h。
（3）透明：花芽从100%乙醇取出后依次经1/2二甲苯+1/2无水乙醇、二甲苯透明，每一级2h。
（4）浸蜡：脱水时间足够后，将杯中的二甲苯倒掉一部分，留约1/3左右的二甲苯置于杯中，然后塞入软蜡蜡屑，放入温度为38℃的烘箱中过夜，第二天将软蜡倒掉，倒入纯蜡蜡液，将烘箱温度调整为62℃，4h换一次纯蜡，共换3次。
（5）包埋：将融化的纯蜡和材料的混合物一起倒入纸盒中，用加热的镊子将其铺开排列整齐，然后将其浸入冷水中使其冷却凝固。
（6）切片：找到材料的纵切和横切方向，将其粘在蜡台上。将粘好蜡块的蜡台固定在切片机上，并使蜡块的水平方向与刀片平行，进行连续切片，切片厚度8～10μm。
（7）粘片：取干净的载玻片，在上面涂上适量的明胶，滴加少量蒸馏水，从蜡带上切下1小段粘在载玻片上，在42℃展台上展片，切片烘干展平后取下放入切片盒中，放置2d以上方可染色。
（8）染色封片：采用番红-固绿对染，石蜡切片→二甲苯脱蜡（5min）→1/2二甲苯+1/2无水乙醇（2min）→100%乙醇（2min）→95%乙醇（2min）→85%乙醇（2min）→70%乙醇（2min）→50%乙醇（2min）→蒸馏水（2min）→1%番红染液（2h）→蒸馏水（1min）→50%乙醇（1min）→70%乙醇（1min）→85%乙醇（1min）→95%乙醇（1min）→0.1%或0.5%固绿染液（40s）→95%酸酒精（1min）→100%乙醇（2min）→1/2二甲苯+1/2无水乙醇（2min）→二甲苯透明（5min）→树胶封片，贴好标签。其中樹胶的配方为明胶2g、石炭酸4g、甘油30mL、蒸馏水200mL。
1.3观察与照相
在光学显微镜下观察做好的切片，并用数码相机进行拍照。
2结果与分析
2.1白楠花的形态结构分析
白楠花的整体结构，自外向内由外层苞片、内层苞片、雄蕊、雌蕊组成，白楠花中存在着很多粘液细胞和油细胞（图1a）。白楠有雄蕊9枚，外轮6枚，内轮3枚，并且存在着腺体（图1b）。一个成熟的花药是由花粉囊和药隔两部分组成，白楠的花药有四室，花药由表皮、药室内壁、中层和绒毡层组成，在药室内壁上可以观察到明显的粘液细胞（图1c）。
关于白楠雌蕊的形态结构，观察发现在白楠中存在着少数双胚现象，由图1d可以看到胚囊中有两个正在发育的胚珠。白楠的胚珠为倒生胚珠（图1e），形成倒生胚珠的原因为分裂后两侧生长的速度不一致而导致。白楠柱头的形状为两头窄，中间较宽，在柱头旁边还存在着腺体（图1f）。
a.花的纵切b.花的横切c.花药四室d.白楠的双胚珠现象e.倒生胚珠f.雌蕊的纵切
摘要：白楠为樟科楠属植物，是优秀的生态树种和珍贵的用材树种，具有很高的价值。本文采用石蜡切片法对白楠（Phoebeneurantha）的胚胎发育过程进行了研究。主要内容包括白楠大、小孢子发生，雌、雄配子体的发育以及开花后子房发育的研究。主要研究结果表明，白楠的子房为一室，双珠被，厚珠心，多单胚珠，少数双胚珠，倒生。胚囊发育类型为蓼型胚囊，与樟科其他属种一致，大孢子母细胞经过减数分裂形成直线排列的四个大孢子，其中三个靠近珠孔端的大孢子相继退化死亡，而合点端的大孢子则发育成为功能大孢子，形成单核胚囊，经过三次分裂，形成八核七细胞的成熟胚囊。雄蕊花药为四室，花药壁自外向内分别为表皮、药室内壁、中层和绒毡层，随着花药的进一步发育，药室内壁和绒毡层逐渐解体消失，成熟花粉为二细胞型花粉，绒毡层类型为变形绒毡层。小孢子有部分败育现象，这可能是由于绒毡层不能及时降解，导致小孢子无法吸收营养，从而导致败育。
关键词：白楠；大、小孢子发生；雌、雄配子体发育；败育
中图分类号：Q132文献标识码：A文章编号：1004-3020（2017）06-0006-06TheMegasporogenesis，
Microsporogenesis，FemaleandMaleGametophyteDevelopmentofPhoebeneuranthaDengJinsheng（1）ZhangJian（2）FangHongling（1）ZhangXin（1）YuFeng（1）DuDan（1）WangKun（1）
（1.FayeEcologicalEnvironmentGroupCo.，LTDWuhan430206；2.YangtzeUniversityJingzhou434100）Abstract：PhoebeneuranthaisexcellentecologicalspeciesandraretreespeciesofLauraceaePhoebenees，hasaveryhighvalue.MethodofusingparaffinPhoebeneuranthatostudytheprocessofembryonicdevelopment.Maincontentsincludethemegasporogenesis，microsporogenesis，developmentofmaleandfemalegametophyteandstudyonovarydevelopmentafterflowering.MainresultsshowthattheovaryofPhoebeneuranthahad1-locules，doubleintegyment，thicknucellus，singleovule，afewpairofovules，ovuleswasanatropous.Embryosacdevelopmenttypeforpolygonumtype，andLauraceaeotherisspeciesconsistent，themegasporesmothercellformedalineartetradof4megasporesaftermeiosis.Thechalazalmegasporedevelopedthefunctionaloneandotherthreeatthemicropylarpoleweredegraded.Formedsinglenuclearembryosac，afterthreetimessplit，formedeightnuclearsevencellofmatureembryosac.Therewrer4loculesanthersacinflowers，Thewallofflowersisconsistofepiderment，endothecaendothecium，middlelamellaandtapetum.Alongwiththefurtherdevelopmentoftheanther，endotheciumanddisintegrationoftapetalcellsgraduallydisappear，maturepollengrainswere2-celledtypes.Thetapetumwasamoeboid.Therewerelittlepollenabortionandmalesterilitysincethetapetumofmalesterileplantsdelayeddegradationandthemicrosporescouldnotobtainenoughnutritionfornormaldevelopment.
Keywords：Phoebeneurantha；megasporogenesisandmicrosporogenesis；maleandfemalegametophytesdevelopment；abortion
白楠是樟科楠屬植物，为多年生大灌木至乔木，通常高3～14m；树皮灰黑色。小枝刚开始有较短柔毛或是长柔毛，柔毛会随着发育逐渐消失。叶为革质叶，狭披针形、披针形或倒披针形，长80～160cm，宽15～40cm，叶片先端尾状渐尖，基部渐狭下延，极少为楔形，叶片上面无毛或嫩时有毛，下面为绿色或苍白色，叶片嫩时有或多或少的灰白色柔毛，后来会逐渐变为散生柔毛或是无毛，叶脉的中脉下陷，叶片两边分别有侧脉8～12条，且有着较明显的横脉和小脉；叶柄长7～15mm，被柔毛或近于无毛。白楠为圆锥花序，花长4～5mm，花梗被毛，长3～5mm；花被片为卵状，外轮的花被较短且狭窄，内轮与之相反，长且宽，花被片先端不尖，较钝，内面毛特别密集；每轮花丝上有较长柔毛，花内腺体没有柄，着生在第三轮花丝的基部，退化后的雄蕊有柄，且有较长柔毛；子房球形，花柱伸长，柱头盘状。果实为卵形，长度为1mm，宽度为7mm；在生长发育时果梗会略微变粗；宿存的花被片为革质，排列较松散，花被片的先端有时会向外倾斜，具有明显的纵脉。花期5月，果期8～10月[1]。
白楠为耐阴树种，适合生长在气候温暖湿润的地方，对土质的要求为较疏松且排水较良好的土地，尤其是在中性或偏酸性的壤质土地上，生长得非常良好，白楠的根部有着很强的萌发力，能短期耐涝。寿命较长，较抗虫，能长成大径材[2]。主要生长在山地密林中，产于我国的湖北、江西、四川、云南、贵州等地。
白楠是珍贵的用材树种。木材颜色为黄褐色，与樟科植物一样具有芳香味。且木材的构造较细，硬度较强，密度不大，不容易受到挤压变形，耐腐蚀不容易被虫蛀。木材易加工，经过稍微加工木材纹理就会变得光滑美观，是用来做家具、雕刻和建筑的非常好的材料。也是用来制作紧密仪器和造船材料的不二选择[3]。且树形优美，枝繁叶茂，生长非常迅速，是极佳的庭荫树种和绿化树种。同时白楠也是亚热带常绿阔叶林中及其重要的伴生树种，有着非常强大的生态调节功能。所以发掘和使用白楠这一珍贵树种资源具有重要意义[4]。
湖北林业科技第46卷第6期邓金胜，等：白楠大小孢子发生与雌雄配子体的发育观察楠木向来有“木中金子”之称，其材质通直圆满、纹理美观、结构细致、质韧难朽、奇香不衰，用途十分广泛，为江南四大名木之冠。由于楠木巨大的经济价值和广泛的用途，导致其野生资源被破坏得极其严重，目前已难觅天然楠木林，许多楠属植物沦为濒危或渐危树种[5]。根据《中国植物红皮书—稀有濒危植物名录》（第一册）和1999年国务院批准发布的《国家重点保护野生植物名录》（第一批），楠属的楠木（Phoebezhennan）、闽楠（P.boumei）、浙江楠（P.chekiangensis）、滇楠（P.nanmu）等均为濒危种，为国家Ⅱ级保护植物[6-7]。要保护楠木资源，首要任务是要为其提供较强的繁殖能力。从繁殖的角度来看，种子植物有性生殖过程大致可分为4个阶段：雌雄配子的发育、传粉与受精、胚发育和
果实（种子）成熟、成熟种子散步与萌发[8]。
而目前对于楠木各个树种的研究报道很少，无法对其生殖生育的整个过程形成一个系统的认识，对于白楠的研究几乎没有。本研究在前人的研究基础上，对白楠花发育过程中，大、小孢子发生及雌、雄配子体的形成进行了详细的细胞学观察和研究，旨在为该种资源保护、良种繁殖和系统进化研究提供生殖生物学方面的基础资料。
1材料与方法
1.1实验材料
本研究采用的实验材料来自长江大学盆景园内的白楠树。从它的花期开始，每隔3d采集一次，采集不同时期的白楠花，取材料时用高枝剪剪下。采集材料之后用70%FAA溶液进行固定。70%FAA溶液由5mL甲醛、冰5mL乙酸和90mL70%乙醇组成。
1.2实验方法
1.2.1常规石蜡切片法的制片过程
（1）材料固定：将小花投入装有FAA固定液（20倍材料）中的青霉素小瓶，用真空抽气泵缓慢抽去花芽中的气泡，等到花芽沉入瓶底后，停止抽气，更换FAA固定液。放入4℃冰箱，固定4h以上。
（2）脱水：抽气完成后，将花芽从FAA中取出，依次通过50%、70%、85%、95%、100%浓度的酒精浸泡润洗，每个浓度浸泡2h。
（3）透明：花芽从100%乙醇取出后依次经1/2二甲苯+1/2无水乙醇、二甲苯透明，每一级2h。
（4）浸蜡：脱水时间足够后，将杯中的二甲苯倒掉一部分，留约1/3左右的二甲苯置于杯中，然后塞入软蜡蜡屑，放入温度为38℃的烘箱中过夜，第二天将软蜡倒掉，倒入纯蜡蜡液，将烘箱温度调整为62℃，4h换一次纯蜡，共换3次。
（5）包埋：将融化的纯蜡和材料的混合物一起倒入纸盒中，用加热的镊子将其铺开排列整齐，然后将其浸入冷水中使其冷却凝固。
（6）切片：找到材料的纵切和横切方向，将其粘在蜡台上。将粘好蜡块的蜡台固定在切片机上，并使蜡块的水平方向与刀片平行，进行连续切片，切片厚度8～10μm。
（7）粘片：取干净的载玻片，在上面涂上适量的明胶，滴加少量蒸馏水，从蜡带上切下1小段粘在载玻片上，在42℃展台上展片，切片烘干展平后取下放入切片盒中，放置2d以上方可染色。
（8）染色封片：采用番红-固绿对染，石蜡切片→二甲苯脱蜡（5min）→1/2二甲苯+1/2无水乙醇（2min）→100%乙醇（2min）→95%乙醇（2min）→85%乙醇（2min）→70%乙醇（2min）→50%乙醇（2min）→蒸馏水（2min）→1%番红染液（2h）→蒸馏水（1min）→50%乙醇（1min）→70%乙醇（1min）→85%乙醇（1min）→95%乙醇（1min）→0.1%或0.5%固绿染液（40s）→95%酸酒精（1min）→100%乙醇（2min）→1/2二甲苯+1/2无水乙醇（2min）→二甲苯透明（5min）→树胶封片，贴好标签。其中樹胶的配方为明胶2g、石炭酸4g、甘油30mL、蒸馏水200mL。
1.3观察与照相
在光学显微镜下观察做好的切片，并用数码相机进行拍照。
2结果与分析
2.1白楠花的形态结构分析
白楠花的整体结构，自外向内由外层苞片、内层苞片、雄蕊、雌蕊组成，白楠花中存在着很多粘液细胞和油细胞（图1a）。白楠有雄蕊9枚，外轮6枚，内轮3枚，并且存在着腺体（图1b）。一个成熟的花药是由花粉囊和药隔两部分组成，白楠的花药有四室，花药由表皮、药室内壁、中层和绒毡层组成，在药室内壁上可以观察到明显的粘液细胞（图1c）。
关于白楠雌蕊的形态结构，观察发现在白楠中存在着少数双胚现象，由图1d可以看到胚囊中有两个正在发育的胚珠。白楠的胚珠为倒生胚珠（图1e），形成倒生胚珠的原因为分裂后两侧生长的速度不一致而导致。白楠柱头的形状为两头窄，中间较宽，在柱头旁边还存在着腺体（图1f）。
a.花的纵切b.花的横切c.花药四室d.白楠的双胚珠现象e.倒生胚珠f.雌蕊的纵切
