多环芳烃污染土壤的微生物修复技术研究进展
吴枭雄 王红旗 刘自力
摘要：多环芳烃是一种存在于各类环境介质中的持久性有机污染物，对环境以及人类健康生存都有很大的危害。由于其高度疏水性，多环芳烃在自然界中难以被降解。对于受多环芳烃污染土壤的修复问题，微生物修复技术因其高效、经济等特点而受到广泛关注。本文论述了微生物降解多环芳烃的机理，并结合国内外的研究现状介绍了几种常见的土壤微生物修复技术，展望了微生物修复多环芳烃污染土壤的技术的发展方向。
关键词：多环芳烃；土壤污染；土壤微生物修复技术；降解机理
中图分类号：X131.3 文献标识码：A 文章编号：2095-672X（2018）07-0108-02
DOI：10.16647/j.cnki.cn15-1369/X.2018.07.063
Progress in research on microbial remediation of polycyclic aromatic hydrocarbon contaminated soil
Wu Xiaoxiong， Wang Hongqi， Liu Zili
（ Institute of Water Sciences， Beijing Normal University， Beijing 100875，China）
Abstract： PAHs are persistent organic pollutants that exist in various environmental media and are harmful to the environment and human health. Due to its high hydrophobicity， PAHs are difficult to be degraded in nature. For the restoration of polycyclic aromatic hydrocarbon-contaminated soils， microbial remediation technology has received extensive attention due to its high efficiency， economy， and other characteristics. This paper discusses the mechanism of microbial degradation of polycyclic aromatic hydrocarbons. Combined with the research status at home and abroad， several common soil microbial remediation technologies are introduced. The development direction of the technology for microbial remediation of polycyclic aromatic hydrocarbon-contaminated soils is prospected.
Key words： PAHs； Soil pollution； Soil microbial remediation； Degradation mechanism
多环芳烃（polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs）是有包括两个及两个以上镶嵌在一起的芳香环组成在一起的一大类有机化合物，已鉴定出的种类有100多种。多环芳烃可自然形成（如碳化等），但其主要来源是在石油开采、工业生产以及进行其他人类活动时，导致有机物不完全燃烧或者热裂解，形成PAHs并释放出来，其化学性质稳定，很难被降解，而且大部分具有致癌性与致突变性，会对人类的健康产生巨大的危害。美国环保署（US EPA）已经将16种多环芳烃作为优先控制污染物。对多环芳烃的研究获得社会的广泛关注。
生物修复技术（Bioremediation）是20世纪80年代以来出现并发展的清除和治理环境污染的生物工程技术。其主要运用了生物代谢、分解污染物质的能力，去除环境中的污染物，达到清除环境污染的目的。由于其具有设备简单、操作便捷、低成本高效率等特点，生物修复技术近年来有了迅猛的发展。而土壤微生物修复技术（Soil bioremediation）则是利用土著微生物或者经过人工驯化后具有某种特定功能的微生物，在一定的环境条件下，通过代谢作用降解土壤中的有害物质或者降低污染物活性，从而达到修复受污染土壤的目的。利用微生物修复技术治理多环芳烃污染土壤也成为现在的研究热点之一。
1 微生物降解多环芳烃的机制
自然界的微生物多种多样，具有非常强的分解代谢能力和较高的代谢效率。比较常见的多环芳烃降解细菌有鞘氨醇单胞属、分支杆菌属芽孢、不动杆菌属、芽孢杆菌属、假单胞菌属、红球菌菌属和伯克氏菌属等[1]，这些高效降解菌大多数是从被多环芳烃污染的土壤和沉积物中分离出来。不同于细菌，一些真菌也具有降解多环芳烃的能力，其中，最常见的是白腐真菌[2]。它们通过分泌胞外酶，如：木质素、漆过氧化物胞外酶，可以将高毒性的多环芳烃分解。
微生物降解PAHs有两种方式：（1）以PAHs为唯一碳源和能源；（2）PAHs与其他有机质进行共代谢[4]。通常环数较低的PAHs（2环或3环）能很快被降解，在环境中存在时间较短，微生物可以以其为唯一碳源和能源的方式进行代谢与降解。而许多4环或多环的PAHs难以作为唯一碳源和能源被微生物降解，主要是以共代谢的方式进行。研究了苯并[a]芘在以邻苯二甲酸、琥珀酸钠作为共代謝底物时，微生物对其的降解效果，结果表明，琥珀酸钠相对于邻苯二甲酸可以更好的加强共代谢作用，并提高苯并[a]芘的微生物降解率。
微生物降解 PAHs 依赖于加氧酶的活性，加氧酶分为单加氧酶和双加氧酶。真菌一般会产生单加氧酶，在单加氧酶的作用下把一个氧原子加到多环芳烃中，使多环芳烃开环并形成芳烃的氧化物，继而被氧化成为反式双氢乙醇和酚类。而细菌主要产生双加氧酶，使多环芳烃开环并氧化成芳烃类过氧化物，再进一步氧化为龙胆酸等中间代谢物，最后苯环断开，产生琥珀酸、乙酸、丙酮酸和乙醛。所有这些产物都会进入三羧酸循环，被微生物用来合成自身的细胞蛋白质和能量，并最终产生CO2和H2O，达到降解的目的。
研究了微生物降解萘和菲的机制，其中萘降解过程中出现的邻苯二酚-2，3-双加氧酶、邻苯二酚-1，2-双加氧酶是主要的限速酶。菲降解途径中限速酶有3，4-双羟基菲双加氧酶、1-羟基-2-萘甲醛羟化酶和羟基化双加氧酶，其中间产物1-羟基-2-萘甲酸在邻位裂解酶与间位裂解酶的作用下生成萘二酚，之后降解途径与萘类似，多数是通过水杨酸途径、龙胆酸途径进入TCA循环。研究Pesudomonas sp.TN301菌降解萘的过程中时发现，龙胆酸及邻苯二酚在邻苯二酚-2，3-双加氧酶和邻苯二酚-1，2-双加氧酶等多种酶的作用下经一系列连续降解反应并最终进入TCA循环。
2 微生物降解技术
2.1 原位微生物修复技术
2.1.1 土著菌培养法
由于在实际应用中向污染土壤接种的工程菌不易维持其活性，因此需要考虑激活污染土壤地区的土著菌，同时对土著菌进行微生物培养，向污染土壤中投加氧源及其他营养物质等，以满足土著菌的生存需要，使其迅速繁殖并通过代谢降解污染物。受污染土壤在这个过程中基本不被搅动。
而在现场环境中，营养盐的缺乏通常是影响微生物活性以及降解效率的主要因素。为了提高其降解效率，可适当添加营养物质，促进污染物的降解。目前，外加营养盐主要用于受石油烃化合物污染环境的生物修复。例如，添加酵母膏或酵母废液可以促进石油烃化合物的降解。
2.1.2 投菌法
直接向污染土壤接入经过实验室筛选、培养的降解菌（从自然环境中定向筛选的微生物，或者是基因工程菌），并提供微生物生长所需要的N、P等营养元素，从而使污染物被降解菌代谢降解。而在实际现场处理过程中，投菌法的处理效果往往不尽如人意，其原因主要在于土著微生物与引入的外源微生物之间存在营养竞争的问题，而营养盐又常是环境中多环芳烃降解的限制因子。所以，实际应用时要综合考虑由实验室培养出的降解菌在处理现场的存活率问题。
2.1.3 土地耕作法
土地耕作处理是现场处理方法中的主要手段，通过施肥、灌溉和加石灰等措施，平衡土壤中营养元素的比例、调节土壤中的水分和pH值，以优化微生物的生长条件，同时对受污染土壤进行耕作，翻动土壤可以改善土壤的通气状况，使土壤充氧，激发微生物代谢速率，以达到降解污染物的目的。
2.2 异位微生物修复技术
2.2.1 预制床法
预制床法是将受污染的土壤平铺在不渗漏的平台上，加上营养液和水，定期翻动充氧，将处理过程中的渗透水回灌于土层上，以完全清除污染物。降解过程多使用土著微生物进行降解，但为了提高修复效果，一般还会引入实验室驯化培养的微生物。一般通过施肥、灌溉以及调节pH值等措施，可以使预制床中的微生物达到适合降解污染物的最优状态。在原位修复技术中，土壤耕作处理的一大缺陷是污染物可能从处理区迁移，而预制床由于其底面为渗透材料多为渗透性低的物质（聚乙烯或粘土等），同时配备有滤液收集和控制排放系统，可以使污染物的迁移量大幅度减少，因此可以将其视为土壤耕作法的一种改良与延续[3]。
2.2.2 土壤堆肥法
土壤堆肥法是通过多种微生物（细菌、真菌和原生动物等）的新陈代谢活动来降解污染物的方法，其设备要求简单，并且能够调控过程参数（温度、pH等）。在堆肥过程中，可以控制这些环境因素，调节至微生物最适宜的生长环境，促进繁殖，提高污染物的降解率。除此之外，在微生物降解污染物的过程中会产生一定热量，升高堆温，进而提高微生物的生长代谢速率，有利于微生物修复效果。采用堆肥法对油污土壤进行微生物处理，并通过检测堆制实验过程中的温度、pH、菌数和总油污含量的变化，来考察实验室筛选得到的高效石油降解菌治理现场油污土壤的效果，研究发现生物去除率可达42%。
在实验室尺度和场地尺度两种条件下对比研究了堆肥法修复多环芳烃污染土壤的效果，研究表明经过180天的修复，多环芳烃的总降解率达到90%，并发现了细菌群落在修复场地中的变化，其中γ-变形菌菌属的细菌持续存在着，而β-变形菌菌属的细菌直到90天后才会出现，此时的多环芳烃浓度足够低，土壤已无生态毒性。
2.2.3 生物反应器法
生物反应器法是将污染土壤置于一种特殊的反应器装置中进行处理，一般可以建在现场或特定的处理区，通常为卧鼓状和气提式。处理时，将污染土壤转移至反应器中，加入足量水充分混合至泥浆状，并加入各类营养物质并剧烈搅拌使氧气充足，微生物与污染土壤充分接触，完成处理过程。由于反应器能够使土壤与微生物及其他添加物（如营养盐、表面活性剂等）彻底混合均匀，同时可以控制降解的环境条件（温度、pH值等），因而处理速度快，效果好。生物反应器已经开始应用于多环芳烃污染土壤的处理。
在研究中向连续搅拌釜内加入葡萄球菌和芽孢杆菌，并采用分批培养的方式降解多环芳烃污染土壤中的菲、芘及苯[a]并蒽，一段时间后，两者的降解率均接近100%。发现向泥浆生物反应器中加入有机废弃物（2.5%发酵牛粪和2.5%造纸干粉）可以提高多环芳烃降解菌的数量，强化微生物对多花芳烃污染土壤的修复。
3 展望
土壤中多环芳烃污染的治理与修复问题一直都被社会所关注，各类土壤微生物修复技术日趋成熟，但仍然存在一些方面需要进一步研究。（1）加强对微生物降解多环芳烃的降解机理与主要控速步骤的研究，构建合理的微生物降解动力学模型。（2）加强对共代谢机制的研究，尤其是对高环数的多环芳烃降解机制研究，以及在共代谢降解过程中，不同的多环芳烃降解会对其他多环芳烃降解产生何种影响。（3）分析研究土壤微生物修复技术最适宜的工作条件，包括环境因素与工艺过程的参数等，例如pH、温度等，因地制宜，从而提高微生物的降解效率。
参考文献
[1]杨晓磊， 陆贻通， 曹林奎. 多环芳烃荧蒽降解菌的筛选鉴定及降解特性研究[J]. 科技通报，2007（01）：46-51.
[2]李慧蓉. 白腐真菌的研究进展[J]. 环境科学进展， 1996（06）：70-78.
[3]王银善. 生物碳固定化白腐真菌修复PAHs污染土壤及作用机理[D]. 杭州：浙江大学，2010.
[4]侯梅芳， 潘栋宇， 黄赛花， 等. 微生物修复土壤多环芳烃污染的研究进展[J].生态环境学报，2014（07）：1233-1238.
收稿日期：2018-04-19
基金项目：国家自然科学基金（NO.41772234）。
作者简介：吴梟雄（1995-），男，研究生，研究方向为微生物修复技术。
通讯作者：王红旗（1960-），男，博士，教授，研究方向为污染土壤修复机理与修复技术。
摘要：多环芳烃是一种存在于各类环境介质中的持久性有机污染物，对环境以及人类健康生存都有很大的危害。由于其高度疏水性，多环芳烃在自然界中难以被降解。对于受多环芳烃污染土壤的修复问题，微生物修复技术因其高效、经济等特点而受到广泛关注。本文论述了微生物降解多环芳烃的机理，并结合国内外的研究现状介绍了几种常见的土壤微生物修复技术，展望了微生物修复多环芳烃污染土壤的技术的发展方向。
关键词：多环芳烃；土壤污染；土壤微生物修复技术；降解机理
中图分类号：X131.3 文献标识码：A 文章编号：2095-672X（2018）07-0108-02
DOI：10.16647/j.cnki.cn15-1369/X.2018.07.063
Progress in research on microbial remediation of polycyclic aromatic hydrocarbon contaminated soil
Wu Xiaoxiong， Wang Hongqi， Liu Zili
（ Institute of Water Sciences， Beijing Normal University， Beijing 100875，China）
Abstract： PAHs are persistent organic pollutants that exist in various environmental media and are harmful to the environment and human health. Due to its high hydrophobicity， PAHs are difficult to be degraded in nature. For the restoration of polycyclic aromatic hydrocarbon-contaminated soils， microbial remediation technology has received extensive attention due to its high efficiency， economy， and other characteristics. This paper discusses the mechanism of microbial degradation of polycyclic aromatic hydrocarbons. Combined with the research status at home and abroad， several common soil microbial remediation technologies are introduced. The development direction of the technology for microbial remediation of polycyclic aromatic hydrocarbon-contaminated soils is prospected.
Key words： PAHs； Soil pollution； Soil microbial remediation； Degradation mechanism
多环芳烃（polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs）是有包括两个及两个以上镶嵌在一起的芳香环组成在一起的一大类有机化合物，已鉴定出的种类有100多种。多环芳烃可自然形成（如碳化等），但其主要来源是在石油开采、工业生产以及进行其他人类活动时，导致有机物不完全燃烧或者热裂解，形成PAHs并释放出来，其化学性质稳定，很难被降解，而且大部分具有致癌性与致突变性，会对人类的健康产生巨大的危害。美国环保署（US EPA）已经将16种多环芳烃作为优先控制污染物。对多环芳烃的研究获得社会的广泛关注。
生物修复技术（Bioremediation）是20世纪80年代以来出现并发展的清除和治理环境污染的生物工程技术。其主要运用了生物代谢、分解污染物质的能力，去除环境中的污染物，达到清除环境污染的目的。由于其具有设备简单、操作便捷、低成本高效率等特点，生物修复技术近年来有了迅猛的发展。而土壤微生物修复技术（Soil bioremediation）则是利用土著微生物或者经过人工驯化后具有某种特定功能的微生物，在一定的环境条件下，通过代谢作用降解土壤中的有害物质或者降低污染物活性，从而达到修复受污染土壤的目的。利用微生物修复技术治理多环芳烃污染土壤也成为现在的研究热点之一。
1 微生物降解多环芳烃的机制
自然界的微生物多种多样，具有非常强的分解代谢能力和较高的代谢效率。比较常见的多环芳烃降解细菌有鞘氨醇单胞属、分支杆菌属芽孢、不动杆菌属、芽孢杆菌属、假单胞菌属、红球菌菌属和伯克氏菌属等[1]，这些高效降解菌大多数是从被多环芳烃污染的土壤和沉积物中分离出来。不同于细菌，一些真菌也具有降解多环芳烃的能力，其中，最常见的是白腐真菌[2]。它们通过分泌胞外酶，如：木质素、漆过氧化物胞外酶，可以将高毒性的多环芳烃分解。
微生物降解PAHs有两种方式：（1）以PAHs为唯一碳源和能源；（2）PAHs与其他有机质进行共代谢[4]。通常环数较低的PAHs（2环或3环）能很快被降解，在环境中存在时间较短，微生物可以以其为唯一碳源和能源的方式进行代谢与降解。而许多4环或多环的PAHs难以作为唯一碳源和能源被微生物降解，主要是以共代谢的方式进行。研究了苯并[a]芘在以邻苯二甲酸、琥珀酸钠作为共代謝底物时，微生物对其的降解效果，结果表明，琥珀酸钠相对于邻苯二甲酸可以更好的加强共代谢作用，并提高苯并[a]芘的微生物降解率。
微生物降解 PAHs 依赖于加氧酶的活性，加氧酶分为单加氧酶和双加氧酶。真菌一般会产生单加氧酶，在单加氧酶的作用下把一个氧原子加到多环芳烃中，使多环芳烃开环并形成芳烃的氧化物，继而被氧化成为反式双氢乙醇和酚类。而细菌主要产生双加氧酶，使多环芳烃开环并氧化成芳烃类过氧化物，再进一步氧化为龙胆酸等中间代谢物，最后苯环断开，产生琥珀酸、乙酸、丙酮酸和乙醛。所有这些产物都会进入三羧酸循环，被微生物用来合成自身的细胞蛋白质和能量，并最终产生CO2和H2O，达到降解的目的。
研究了微生物降解萘和菲的机制，其中萘降解过程中出现的邻苯二酚-2，3-双加氧酶、邻苯二酚-1，2-双加氧酶是主要的限速酶。菲降解途径中限速酶有3，4-双羟基菲双加氧酶、1-羟基-2-萘甲醛羟化酶和羟基化双加氧酶，其中间产物1-羟基-2-萘甲酸在邻位裂解酶与间位裂解酶的作用下生成萘二酚，之后降解途径与萘类似，多数是通过水杨酸途径、龙胆酸途径进入TCA循环。研究Pesudomonas sp.TN301菌降解萘的过程中时发现，龙胆酸及邻苯二酚在邻苯二酚-2，3-双加氧酶和邻苯二酚-1，2-双加氧酶等多种酶的作用下经一系列连续降解反应并最终进入TCA循环。
2 微生物降解技术
2.1 原位微生物修复技术
2.1.1 土著菌培养法
由于在实际应用中向污染土壤接种的工程菌不易维持其活性，因此需要考虑激活污染土壤地区的土著菌，同时对土著菌进行微生物培养，向污染土壤中投加氧源及其他营养物质等，以满足土著菌的生存需要，使其迅速繁殖并通过代谢降解污染物。受污染土壤在这个过程中基本不被搅动。
而在现场环境中，营养盐的缺乏通常是影响微生物活性以及降解效率的主要因素。为了提高其降解效率，可适当添加营养物质，促进污染物的降解。目前，外加营养盐主要用于受石油烃化合物污染环境的生物修复。例如，添加酵母膏或酵母废液可以促进石油烃化合物的降解。
2.1.2 投菌法
直接向污染土壤接入经过实验室筛选、培养的降解菌（从自然环境中定向筛选的微生物，或者是基因工程菌），并提供微生物生长所需要的N、P等营养元素，从而使污染物被降解菌代谢降解。而在实际现场处理过程中，投菌法的处理效果往往不尽如人意，其原因主要在于土著微生物与引入的外源微生物之间存在营养竞争的问题，而营养盐又常是环境中多环芳烃降解的限制因子。所以，实际应用时要综合考虑由实验室培养出的降解菌在处理现场的存活率问题。
2.1.3 土地耕作法
土地耕作处理是现场处理方法中的主要手段，通过施肥、灌溉和加石灰等措施，平衡土壤中营养元素的比例、调节土壤中的水分和pH值，以优化微生物的生长条件，同时对受污染土壤进行耕作，翻动土壤可以改善土壤的通气状况，使土壤充氧，激发微生物代谢速率，以达到降解污染物的目的。
2.2 异位微生物修复技术
2.2.1 预制床法
预制床法是将受污染的土壤平铺在不渗漏的平台上，加上营养液和水，定期翻动充氧，将处理过程中的渗透水回灌于土层上，以完全清除污染物。降解过程多使用土著微生物进行降解，但为了提高修复效果，一般还会引入实验室驯化培养的微生物。一般通过施肥、灌溉以及调节pH值等措施，可以使预制床中的微生物达到适合降解污染物的最优状态。在原位修复技术中，土壤耕作处理的一大缺陷是污染物可能从处理区迁移，而预制床由于其底面为渗透材料多为渗透性低的物质（聚乙烯或粘土等），同时配备有滤液收集和控制排放系统，可以使污染物的迁移量大幅度减少，因此可以将其视为土壤耕作法的一种改良与延续[3]。
2.2.2 土壤堆肥法
土壤堆肥法是通过多种微生物（细菌、真菌和原生动物等）的新陈代谢活动来降解污染物的方法，其设备要求简单，并且能够调控过程参数（温度、pH等）。在堆肥过程中，可以控制这些环境因素，调节至微生物最适宜的生长环境，促进繁殖，提高污染物的降解率。除此之外，在微生物降解污染物的过程中会产生一定热量，升高堆温，进而提高微生物的生长代谢速率，有利于微生物修复效果。采用堆肥法对油污土壤进行微生物处理，并通过检测堆制实验过程中的温度、pH、菌数和总油污含量的变化，来考察实验室筛选得到的高效石油降解菌治理现场油污土壤的效果，研究发现生物去除率可达42%。
在实验室尺度和场地尺度两种条件下对比研究了堆肥法修复多环芳烃污染土壤的效果，研究表明经过180天的修复，多环芳烃的总降解率达到90%，并发现了细菌群落在修复场地中的变化，其中γ-变形菌菌属的细菌持续存在着，而β-变形菌菌属的细菌直到90天后才会出现，此时的多环芳烃浓度足够低，土壤已无生态毒性。
2.2.3 生物反应器法
生物反应器法是将污染土壤置于一种特殊的反应器装置中进行处理，一般可以建在现场或特定的处理区，通常为卧鼓状和气提式。处理时，将污染土壤转移至反应器中，加入足量水充分混合至泥浆状，并加入各类营养物质并剧烈搅拌使氧气充足，微生物与污染土壤充分接触，完成处理过程。由于反应器能够使土壤与微生物及其他添加物（如营养盐、表面活性剂等）彻底混合均匀，同时可以控制降解的环境条件（温度、pH值等），因而处理速度快，效果好。生物反应器已经开始应用于多环芳烃污染土壤的处理。
在研究中向连续搅拌釜内加入葡萄球菌和芽孢杆菌，并采用分批培养的方式降解多环芳烃污染土壤中的菲、芘及苯[a]并蒽，一段时间后，两者的降解率均接近100%。发现向泥浆生物反应器中加入有机废弃物（2.5%发酵牛粪和2.5%造纸干粉）可以提高多环芳烃降解菌的数量，强化微生物对多花芳烃污染土壤的修复。
3 展望
土壤中多环芳烃污染的治理与修复问题一直都被社会所关注，各类土壤微生物修复技术日趋成熟，但仍然存在一些方面需要进一步研究。（1）加强对微生物降解多环芳烃的降解机理与主要控速步骤的研究，构建合理的微生物降解动力学模型。（2）加强对共代谢机制的研究，尤其是对高环数的多环芳烃降解机制研究，以及在共代谢降解过程中，不同的多环芳烃降解会对其他多环芳烃降解产生何种影响。（3）分析研究土壤微生物修复技术最适宜的工作条件，包括环境因素与工艺过程的参数等，例如pH、温度等，因地制宜，从而提高微生物的降解效率。
参考文献
[1]杨晓磊， 陆贻通， 曹林奎. 多环芳烃荧蒽降解菌的筛选鉴定及降解特性研究[J]. 科技通报，2007（01）：46-51.
[2]李慧蓉. 白腐真菌的研究进展[J]. 环境科学进展， 1996（06）：70-78.
[3]王银善. 生物碳固定化白腐真菌修复PAHs污染土壤及作用机理[D]. 杭州：浙江大学，2010.
[4]侯梅芳， 潘栋宇， 黄赛花， 等. 微生物修复土壤多环芳烃污染的研究进展[J].生态环境学报，2014（07）：1233-1238.
收稿日期：2018-04-19
基金项目：国家自然科学基金（NO.41772234）。
作者简介：吴梟雄（1995-），男，研究生，研究方向为微生物修复技术。
通讯作者：王红旗（1960-），男，博士，教授，研究方向为污染土壤修复机理与修复技术。
