自体ADSCs联合外膜敷贴对老年患者慢性创面愈合的影响
陆扬
[摘要]目的：探討自体脂肪源性干细胞（Adipose-derived stem cells，ADSCs）联合外膜敷贴对老年患者慢性创面生长因子的影响。方法：选取笔者医院2014年2月-2019年2月收治的老年慢性创面患者84例，根据随机数字表法分成对照组、观察组，各42例。对照组采用外膜敷贴（无菌生物护创膜）治疗，观察组采用自体ADSCs联合外膜敷贴治疗。在患者治疗2个月后复查时评估创面愈合效果。分别在治疗前、治疗2个月时取创面组织检测两组碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、表皮生长因子（EGF）、血管内皮细胞生长因子（VEGF）、血小板衍化生长因子（PDGF）水平，观察创面生长因子的变化。分析两组微血管计数（MVD）的变化，并记录两组创面愈合时间与并发症发生率。结果：观察组愈合率为92.86%显著高于对照组76.19%，差异有统计学意义（P<0.05）。两组治疗后bFGF、EGF、VEGF、PDGF阳性表达率均高于治疗前，且观察组较对照组显著增高（P<0.05）。观察组MVD计数为（38.53±2.45）个，较对照组的[（30.41±3.04）个]更高（P<0.05）。观察组愈合时间为（47.53±5.47）d少于对照组的（55.39±3.86）d，差异有统计学意义（P0.05）。结论：与单用外膜敷贴相比，老年慢性创面患者经自体ADSCs联合外膜敷贴治疗，能上调bFGF、EGF、VEGF、PDGF阳性表达率，提高MVD计数，缩短愈合时间，促进创面修复，疗效更好。
[关键词]慢性创面;自体脂肪源性干细胞;碱性成纤维细胞生长因子;表皮生长因子;并发症;老年患者
Abstract： Objective? To investigate the effect of autologous adipose-derived stem cells （ADSCs） combined with adventitia dressing on growth factor in elderly patients with chronic wounds. Methods? 84 elderly patients with chronic wounds admitted to our hospital from February 2014 to February 2019 were selected and divided into the control group and the observation group according to random number table method， 42 cases in each group. The control group was treated with adventitia application， while the observation group was treated with autologous ADSCs combined with adventitia application. The effect of wound healing was evaluated after 2 months of treatment.The levels of basic fibroblast growth factor （bFGF）， epidermal growth factor （EGF）， vascular endothelial growth factor （VEGF） and platelet-derived growth factor （PDGF） were measured before treatment and 2 months after treatment.The changes of microvessel （MVD） count were analyzed， and the healing time and complication rate were recorded. Results? The healing rate of the observation group （92.86%） was significantly higher than that of the control group （76.19%）， the difference was statistically significant （P<0.05）. The positive rates of bFGF， EGF， VEGF and PDGF in the two groups after treatment were higher than those before treatment， and the positive rates in the observation group were significantly higher than those in the control group （P<0.05）. The MVD count in the observation group was （38.53±2.45）， higher than that in the control group （30.41±3.04， P<0.05）. The mean healing time of the observation group was （47.53±5.47）d， which was significantly shorter than that of the control group [（55.39±3.86）d， P0.05）. Conclusion? Compared with the single application of external membrane， ADSCs combined with external membrane can increase the positive expression rate of bFGF， EGF， VEGF and PDGF， increase the MVD count， shorten the healing time， promote the wound repair and improve the curative effect.
Key words： chronic wound; autologous adipose-derived stem cells; basic fibroblast growth factor; epidermal growth factor; complication; elderly patients
慢性创面的治疗具有一定难度，大多因压力性溃疡、创伤性溃疡、糖尿病性溃疡等因素所致[1]。既往采用常规换药方式治疗，创面愈合需要较长时间，尤其对慢性创面而言，部分患者长期迁延不愈，不仅增加医疗费用，而且加大了患者痛苦[2-3]。研究表明慢性创面延迟愈合的发生与多种因素有关，常见原因为新生血管形成障碍，这是导致创面不愈合的重要因素[4]。近年来，自体脂肪源性干细胞（Adipose-derived stem cells，ADSCs）在慢性创面治疗中被应用，体现出众多优势，如取材方便、培养方便、来源丰富等，它对黏膜功能恢复有促进作用[5]。本研究旨在分析ADSCs联合外膜敷贴对老年患者慢性创面生长因子的影响，进一步了解其治疗价值，做如下报道。
1? 资料和方法
1.1 一般资料：选取笔者医院2014年2月-2019年2月收治的老年慢性创面患者84例，根据随机数表法分成对照组、观察组，各42例。两组一般资料比较差异无统计学意义（P>0.05），见表1。
1.2 纳入与排除标准
1.2.1 纳入标准：①年龄≥60岁;②因糖尿病足、烧伤等引起的慢性创面;③经常规换药治疗达30d，创面未愈;④未见骨、肌肉、肌腱病变;⑤既往無皮瓣种植史;⑥知情同意。
1.2.2 排除标准：①合并血液系统疾病;②心、脑、肺等脏器不全;③处于昏迷状态;④既往有精神、认知障碍史;⑤恶性肿瘤。
1.3 方法：两组均行清创处理，将坏死组织清除，按照药敏试验、细菌培养结果给予抗感染处理。对照组采用外膜敷贴（无菌生物护创膜）治疗，碘伏对创面予以消毒，按照创面大小、形态对无菌护创膜给予裁剪，然后贴于创面，每隔3～7d对外膜敷贴进行1次更换。观察组采用自体ADSCs联合外膜敷贴治疗，无菌生物护创膜治疗与对照组相同，在自体ADSCs抽取前行常规血液检查，于大腿外侧（下腹部也可）抽取脂肪约20ml，离心5min（1 000r/min），获取下层细胞、上层脂肪细胞。取胶原酶（浓度为0.1%）、胰蛋白酶（浓度为0.1%）加入脂肪组织内，水浴（37℃）30min，离心5min（2 000r/min），获得下层细胞，充分混匀，经PBS重悬，离心5min（2 000r/min）。连接培养瓶进行培养，对细胞状态进行观察，每隔3d进行1次换液，当原代细胞融合达到90%后行传代培养。经消化处理后冻存，第2天存放于液氮内，使用前行复苏处理。每次取1×106/cm?细胞量注于创缘和基底，1次/2周。
1.4 观察指标：①创面愈合效果[6]：在患者治疗2个月后复查时评估疗效。治愈：创面组织颜色与周围正常皮肤基本相同，局部无压痛、疼痛表现，无脓液、红肿症状;有效：创面颜色改善，局部有轻度疼痛、红肿;无效：治疗前、后症状无改善。总有效率=（治愈+有效）例数/总例数×100%;②创面生长因子：分别在治疗前、治疗2个月后取创面组织（4mm×4mm），行HE染色，经免疫组化法测定碱性成纤维细胞生长因子（Basic fibroblast growth factor，bFGF）、表皮生长因子（Epidermal growth factor，EGF）、血管内皮细胞生长因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）、血小板衍化生长因子（Platelet-derived growth factor，PDGF）水平，由3名医师计数，利用光学显微镜（400倍）进行观察;③微血管计数（Micro vessel density，MVD）与愈合时间：在治疗1个月时，取肉芽组织行CD31兔抗人多克隆抗体HE染色，将呈棕色内皮细胞簇视作一个MVD，分别利用低、高倍镜观察5个视野，取均值作为最终MVD结果，并记录两组患者的愈合时间;④并发症：包括创面感染、破溃、皮肤坏死等。
1.5 统计学分析：经SPSS 20.0处理数据，计数资料用（%）表示，行χ2检验，等级资料行秩和检验。计量资料用（x?±s）表示，行t检验。P<0.05为差异有统计学意义。
2? 结果
2.1 两组愈合效果比较：观察组总有效率为92.86%较对照组明显增高（76.19%），组间比较差异有统计学意义（P<0.05），见表2。
2.2 两组治疗前后创面生长因子水平比较：两组治疗前创面内bFGF、EGF、VEGF、PDGF比较差异无统计学意义（P>0.05）;两组治疗后bFGF、EGF、VEGF、PDGF阳性表达率均高于治疗前，且观察组较对照组显著增高，差异有统计学意义（P<0.05）。见表3。
2.3 两组MVD计数、愈合时间比较：观察组MVD计数为（38.53±2.45）个显著高于对照组的[（30.41±3.04）个]，差异有统计学意义（P<0.05）。观察组愈合时间为（47.53±5.47）d短于对照组的（55.39±3.86）d，差异有统计学意义（P<0.05）。
2.4 两组并发症发生情况比较：两组创面感染、破溃、皮肤坏死发生率比较差异无统计学意义（P>0.05），见表4。
2.5 典型病例：王某，男，65岁，因烧伤导致慢性创面形成，入院后行自体ADSCs联合外膜敷贴修复治疗，经干预后，创面恢复良好（见图1），局部未见组织坏死、破溃、创面感染等表现。
3? 讨论
慢性创面是外科治疗的一大难题，随着人口老龄化进展，因压疮、糖尿病足引起的慢性创面发生率逐年增高，严重影响生活质量[7]。传统换药治疗效果欠佳，为了改善疗效，临床需寻求更好的治疗方式。目前，无菌生物护创膜（外膜敷贴）在慢性创面治疗中被应用，取得了一定疗效。无菌生物护创膜为半透明生物薄膜，主要材料为猪内脏膜，通过除抗原、消毒等处理后制作而成。该产品具备良好的透气性、柔韧性，研究发现该护创膜对急性创面的治疗效果良好[8]。但有研究指出针对慢性创面者单纯给予护创膜治疗，效果欠佳[9]。
鉴于既往常规治疗效果不理想，本研究选用了新型治疗方式，即在常规外膜敷贴基础上采用自体ADSCs治疗，结果提示该方案能提高愈合效果，并上调多种创面生长因子水平，包括bFGF、EGF、VEGF、PDGF。bFGF表达对胶原生成有较大影响，能诱导胶原生成，修复创面损伤[10]。EGF是生长因子中的一员，对细胞增殖、分化有调节作用，能与EGFR相结合，从而调节细胞表达[11]。研究表明EGF对内细胞、表皮细胞增殖存在促进作用，可促进细胞迁移，能加速创面愈合[12]。VEGF已被证实对血管生长有刺激作用，它能促进血管新生[13]。值得注意的是，因病理改变引起的VEGF表达增高，可导致血管异常增生，诱发肿瘤进展。有研究发现VEGF对骨组织分化有益，有利于提升皮瓣存活率[14]。PDGF通常源自血小板，它属于促细胞分裂剂，可促进细胞分化、分裂[15]。研究指出PDGF可调节纤维母细胞、单核细胞、中性粒细胞，可促使其聚集于创面，且对细胞外基质降解有促进作用[16]。笔者发现自体ADSCs治疗能提高bFGF、EGF、VEGF、PDGF阳性表达率，这为创面愈合提供了良好的内环境。该方案能分化对创面修复有益的细胞，包括内皮细胞、表皮细胞等。动物实验提示ADSCs对创面的修复能力较强，且能减轻炎症，并促使表皮厚度提升，成骨能力、成脂能力均良好，能提升修复质量[17-18]。此外，观察组同时使用创膜敷贴治疗。这种护创膜实际上是猪内脏膜，内含丰富胶原蛋白，经灭菌处理后，能用于创面修复，具有柔韧性好、透气性佳、组织相容性好等特点，可促使创面渗出减少，对创面愈合有促进作用[19]。笔者发现自体ADSCs的应用能进一步上调bFGF、EGF、VEGF、PDGF阳性率，从而提升疗效。
MVD计数与创面愈合疗效密切相关，若患者存在新生血管形成障碍，则会导致MVD计数减少，不利于创面修复。笔者发现观察组MVD计数高于对照组，进一步证实ADSCs的疗效可靠。其机制可能在于ADSCs为血管生成提供了良好条件，而新生血管形成能促进创伤部位愈合[20]。本研究提示观察组愈合时间较对照组缩短，这也提示在外膜敷贴基础上加用ADSCs，有利于创面修复，从而将愈合时间缩短。笔者发现两组并发症发生率比较差异无统计学意义，本次两组并发症率均较低，但临床医师仍需密切关注并发症情况，降低不良事件风险。
综上，与单用外膜敷贴相比，老年慢性创面患者经自体ADSCs联合外膜敷贴治疗，能取得更确切疗效，这可能与该方案上调bFGF、EGF、VEGF、PDGF阳性率有关，有利于提高MVD计数，缩短愈合时间，整体疗效较理想。此外，本研究也有不足，如仅选取84例样本，且设置的观察时点较少，日后需进一步增加样本量与观察时点进行探讨。
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