细菌的严谨反应研究进展

    张腾飞 罗青平 邵华斌 佘治国

    摘要：从严谨反应的发生及其分子机制，严谨反应影响的生理活动等进行了介绍，并以重要病原菌单增李斯特菌、链球菌等为例，阐述了严谨反应对细菌生长、代谢、致病性等的调控作用。以期为解析病原菌的环境适应与致病机制及开发新型药物靶标提供帮助。

    关键词：细菌;严谨反应;（p）ppGpp信号分子

    中图分类号： ? ? ? ?文献标识码：A ? ? ? ?文章编号：1007-273X（2019）12-0014-03

    严谨反应是细菌在遭受环境压力和营养不足时，由（p）ppGpp合成酶催化合成信号分子（p）ppGpp，诱导细菌产生的一系列适应性反应。经典的严谨反应是由氨基酸饥饿引起核糖体在合成蛋白质时发生空转反应，（p）ppGpp合成酶通过与核糖体的相互作用感受氨基酸饥饿，合成信号分子（p）ppGpp，从而引发细菌的适应性调控[1]。进一步研究发现严谨反应可调控细菌多种生理学功能，例如致病菌的存活、复制和传播。因此研究细菌的严谨反应对于解析细菌的环境适应与致病机制与开发新型药物靶标具有重大的意义。

    1 ?严谨反应的产生

    早在40多年前，Cashel和Gallant第一次发现了四磷酸鸟苷（ppGpp）和五磷酸鸟苷（pppGpp），简称为（p）ppGpp类物质。当在氨基酸饥饿条件下，大肠杆菌的细胞通过放射性核酸二维薄层色谱检测到了信号分子，即薄层上的“magic spots”-（p）ppGpp，它是由GDP或GTP从ATP上转移磷酸所合成，与rRNA合成的停止相关。由于细菌感应应激环境产生信号分子（p）ppGpp，进而调节自身的行为以适应环境，因此（p）ppGpp介导的调控反应被定义为严谨反应[1]。

    信号分子（p）ppGpp的水平由两类酶控制，这两类酶分别是只具有合成活性的单功能酶和既能合成又能水解的双功能酶。双功能酶的命名目前没有明确标准，在大肠杆菌中单功能酶被命名为RelA，双功能酶被命名为SpoT，或者RSH（RelA/SpoT同源蛋白）被称为双功能酶。在大肠杆菌中，单功能RelA蛋白和双功能SpoT蛋白都能从ATP上获得磷酸，加载到GDP或GTP上形成ppGpp或pppGpp，但是只有双功能酶才可以水解（p）ppGpp成GDP或GTP和PPi。大部分革兰氏阴性菌，例如大肠杆菌和沙门氏菌都编码RelA和SpoT。如果没有SpoT，细菌则不能降解RelA合成的（p）ppGpp，导致不能减少的核酸积累破坏细胞的周期调控。在这些物种中，SpoT的功能一般在缺乏合成活性的ΔrelAΔspoT双缺菌株[（p）ppGpp0]中被研究。其他的许多致病菌编码（p）ppGpp的途径与RelA/SpoT双酶模式截然不同。例如，结合分枝杆菌、变形杆菌、布氏杆菌等仅编码一个双功能RSH蛋白，而一些革兰氏阳性厚壁菌门，如链球菌、芽孢杆菌等不但可以编码一个双功能RSH蛋白（选择性称为Rel或RelA），而且还可以编码其他一些小的RelA样的合成小片段蛋白（RelP和RelQ）。另外，伽马变形菌和霍乱弧菌可以编码RelV和截断的合成酶[2-4]。多种酶的存在致力于信号分子的合成和水解，说明了细菌进化出多种功能机制来调控（p）ppGpp的水平。

    2 ?严谨反应调控细菌的多种生理学功能

    （p）ppGpp作为信号分子促进细菌的适应和应变能力是其主要功能。为了监测和适应自身所处的环境，细菌依靠其感应系统来调控复杂的生理过程。比如，细菌面对环境压力，更易于调节自身的耐受程度和营养利用途径。像所有的微生物一样，每种病原菌最根本的目标都是存活与复制。然而，为了克服宿主强大的防御机体，病原菌通常需要被赋予毒力相关的性能，例如表面附着，细胞或组织的侵入和传输。很多病原菌都有独特的毒力传播途径和更广泛的适应性途径，比如抗应激能力，通过调整特异的调节子调控全局性的信号网络，包括重要的碳源和氮源代谢途径[5，6]。许多细菌都是依靠核苷酸分子治愈自身的代谢紊乱和协调其生存和毒力的平衡。

    在宿主的复杂环境中，致病菌改變他们的新陈代谢和所利用的蛋白质去响应环境的变化。为了抢占先机，致病菌可能激活特异的分泌系统、运动细胞器或粘附素等。这样，毒力因子可以促进微生物获得营养，增加自身存活率，调控宿主细胞的生物或免疫系统，或让自己处于更有利的环境中。为了应答环境，病原菌利用专门的调节子改变它们的响应方式。许多毒力调节子的表达和激活被融入了（p）ppGpp调节的全局性响应中，从而耦合了致病菌的代谢状态。就其本身而论，细胞内（p）ppGpp水平的调控对致病菌的存活、复制和传播非常重要。

    双功能（p）ppGpp合成/水解蛋白在革兰氏阳性菌中至关重要。例如，在金黄色葡萄球菌中，SpoT蛋白的同系物 （称为RelA）对金黄色葡萄球菌的体外生存非常重要。厚壁菌门的其他成员依赖严谨反应调节自身的全局性生理变化，这种现象也与致病性相关，例如在环境中的持久性和抗生素的耐药性问题。举例说明，能引起肺部炭疽热并在环境中长期存活的炭疽芽孢杆菌依赖relA的存在。医院内越来越普遍的艰难梭菌经常暴露于抗微生物的试剂中，有文献报道当阿莫西林和克林霉素存在时能够上调（p）ppGpp合成/水解酶的表达。

    3 ?多种病原菌中的严谨反应

    3.1 ?严谨反应与单增李斯特菌

    单增李斯特菌能够引起罕见致命的食源性疾病。虽然其感染之后的表现可能仅仅引起非侵入性胃肠炎，但是严重的情况下也可以导致败血症和脑膜炎。这种感染可能反映了潜在的病原菌能够侵入宿主细胞，促进细胞至细胞的传播现象。虽然relQ和relP在李斯特菌的基因组中被鉴定，但是迄今为止只检测到一个双功能酶spoT同系物，称之为Rel或RelA[7]。单增李斯特菌中的（p）ppGpp可以影响生物被膜的形成，缺失了relA的突变株生长出现缺陷，粘附表面的能力也降低。当单增李斯特菌缺失relA后，表现出在培养的细胞系中存活能力降低的现象，包括Caco-2肠上皮细胞和J774. A1巨噬细胞。而由于单增李斯特菌感染引起的严谨反应目前尚不清楚，已报道的两组老鼠感染细菌的实验出现了冲突的结果，因此还需要进一步深入研究。单增李斯特菌的relA缺失突变株维持一定的毒力并依然具有（p）ppGpp的合成活性，Taylor等发现突变株毒力降低可能是由于（p）ppGpp产物的减少。Okada等[8]和Bennett等[9]报道细菌单增李斯特菌在肉汤和培养的细胞系中生长证明了（p）ppGpp适应环境就像面对宿主感染一样。

    3.2 ?嚴谨反应与化脓链球菌

    A群链球菌（GAS）在人体宿主内也能适应各种各样的环境。GAS被证实能够引起各种感染，包括脓包疮（影响皮肤）、肺炎和脑膜炎，包括分泌酶和外毒素等相关毒力因子的表达和其生长过程的营养代谢情况息息相关，特别是对（p）ppGpp的利用尤为重要[10]。和其他革兰氏阳性菌一样，化脓链球菌有两个具有（p）ppGpp合成功能的同源小蛋白RelQ和RelP以及一个双功能蛋白RelA。 因此GAS也能产生不依赖RelA的严谨反应。虽然细菌进入平台期之后，relA的转录谱上调了2倍，但是许多研究工作揭示了在氨基酸饥饿的条件下化脓链球菌的严谨反应可以不依赖RelA。这条通路影响了重要毒力基因的表达。例如调节生长的转录因子RopB，其可以支配分泌蛋白酶外毒素B的speB基因的表达;还能影响双组份调控系统covRS的表达，从而调节溶血素S、链激酶和外毒素B的表达;与寡肽吸收和进程有关的因子opp和dpp通透酶系统和pepB基因也受其影响。氨基酸饥饿能诱导fas操纵子调节毒力和autoinducer-2蛋白的变化。不依赖relA的基因，包括转运蛋白、代谢酶和至少两个毒力基因也受到了影响[11]。

    3.3 ?严谨反应与肺炎链球菌

    像肠球菌和GAS一样，α-溶血性链球菌，比如肺炎链球菌能引起广泛的组织趋向性，造成心内膜炎、中耳炎和菌血症。在肺炎链球菌中，通过信号标签诱变筛选鉴定出一个双功能rel基因，其在肺炎小鼠模型中对菌株保持毒力有着非常重要的作用[12]。肺炎链球菌还编码一个RelQ的同系物，但只能在异源系统中合成（p）ppGpp而不能在其自身细菌体内作用。肺炎链球菌菌株D39的严谨反应依赖rel，可显著诱导ply基因的表达。ply基因编码肺炎球菌的溶血素，能够通过其细胞毒性诱导炎症反应，促进细菌早期感染和侵入肺组织而进入血液循环。缺失ply后，肺炎链球菌对小鼠的毒力显著减弱。肺部感染缺失rel基因的D39菌株后，缺失株对小鼠表现为无毒现象[13]。虽然ply可能受其他一些方式调控，但是其依赖rel的调控作用是肺炎链球菌调控毒力的一个重要部分。

    3.4 ?严谨反应与变形链球菌

    变形链球菌是引起龋齿疾病的重要病原菌。为了适应口腔内环境，变形链球菌能够形成生物被膜，抵抗环境中的不利因素，其对低pH和流动的营养成分具有耐受力。变形链球菌中信号分子（p）ppGpp的代谢也是很复杂的。该细菌有三个（p）ppGpp合成酶，一个双功能RelA蛋白和两个单功能蛋白，分别是RelQ和RelP酶。当细菌面对莫匹罗星处理过的氨基酸饥饿条件时，与糖代谢、生物被膜和遗传能力相关的基因表达便会发生变化。然而，通过判断比较野生菌株和relA突变株的应答反应，研究者发现其中的一些基因并不依赖RelA蛋白。另一方面，在高浓度的碳水化合物的培养基中relA基因的缺失让细菌的生长受到了限制，一些特定糖底物也受到了异常调节。研究发现突变株ΔrelA的生物被膜形成能力更弱，然而缺失了relA之后的生物被膜对酸的耐受能力增加[14]。关于这3个调节（p）ppGpp的合成酶之间的联系仍然需要更进一步的研究。

    4 ?展望

    由此可见，细菌的严谨反应通过调控细菌的代谢、毒力因子表达等一系列生理活动，影响了细菌的环境适应能力与致病性，深入研究病原菌的严谨反应，对解析病原菌的致病机制，开发靶向药物具有重要意义，也将是一个研究的热点。

    参考文献：

    [1] POTRYKUS K，CASHEL M.（p）ppGpp： still magical[J].Annual review of microbiology，2008，62：35-51.

    [2] MAGNUSSON L U，FAREWELL A，NYSTROM T. ppGpp：a global regulator in Escherichia coli[J].Trends microbiol，2005，13（5）：236-242.

    [3] BRAEKEN K，MORIS M，DANIELS R，et al. New horizons for （p）ppGpp in bacterial and plant physiology[J].Trends microbiol，2006，14（1）：45-54.

    [4] SRIVATSAN A，WANG J D. Control of bacterial transcription，translation and replication by （p）ppGpp[J].Current opinion in microbiology，2008，11（2）：100-105.

    [5] GOERKE B，STULKE J. Carbon catabolite repression in bacteria：many ways to make the most out of nutrients[J].Nature reviews microbiology，2008，6（8）：613-624.

    [6] PFLUGER-GRAU K，GORKE B. Regulatory roles of the bacterial nitrogen-related phosphotransferase system[J].Trends microbiol，2010，18（5）：205-214.

    [7] LEMOS J A，LIN V K，NASCIMENTO M M，et al. Three gene products govern （p）ppGpp production by Streptococcus mutans[J].Mol Microbiol，2007，65（6）：1568-1581.

    [8] OKADA Y，MAKINO S，TOBE T，et al.Cloning of rel from Listeria monocytogenes as an osmotolerance involvement gene[J].Appl Environ Microb，2002，68（4）：1541-1547.

    [9] BENNETT H J，PEARCE D M，GLENN S，et al.Characterization of relA and codY mutants of Listeria monocytogenes：identification of the CodY regulon and its role in virulence[J].Mol Microbiol，2007，63（5）：1453-1467.

    [10] CHAUSSEE M A，DMITRIEV A V，CALLEGARI E A，et al. Growth phase-associated changes in the transcriptome and proteome of Streptococcus pyogenes[J].Archives of microbiology，2008，189（1）：27-41.

    [11] MALKE H，STEINER K，MCSHAN W M，et al. Linking the nutritional status of Streptococcus pyogenes to alteration of transcriptional gene expression：the action of CodY and RelA[J].International journal of medical microbiology：IJMM，2006，296（4-5）：259-275.

    [12] HAVA D，CAMILLI A. Large-scale identificationof serotype 4 Streptococcus pneumoniae virulence factors[J].Mol Microbiol，2002，45（5）：1389-1405.

    [13] KAZMIERCZAK K M，WAYNE K J，RECHTSTEINER A，et al. Roles of rel（Spn） in stringent response， global regulation and virulence of serotype 2 Streptococcus pneumoniae D39[J].Mol Microbiol，2009，72（3）：590-611.

    [14] LEMOS J A C，BROWN T A，BURNE R A. Effects of RelA on key virulence properties of planktonic and biofilm populations of Streptococcus mutans[J].Infection and immunity，2004， 72（3）：1431-1440.