基于GEO数据挖掘与网络药理学探讨化痰通络汤治疗脑梗死的机制研究
龚翠兰 周德生 杨仁义 傅馨莹
摘要 目的：采用GEO芯片数据及网络药理学方法，分析脑梗死疾病基因，并对化痰通络汤治疗脑梗死风痰阻络证的作用机制进行探讨，为脑梗死的中医药防治提供理论依据。方法：采用多学科交叉方法对化痰通络汤治疗脑梗死风痰阻络证进行研究，整合GEO、GeneCards、TCMSP、PubChem、Swiss Target Prediction、String、WebGestalt数据库资源，利用Cytoscape、R語言软件，对脑梗死差异基因、疾病靶点、化痰通络汤的中药有效成分、中药靶点进行筛选，从蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）共表达网络、GO及KEGG富集分析角度，探讨化痰通络汤治疗脑梗死风痰阻络证的所用机制。结果：获取3 110个脑梗死疾病靶点，其中203个差异基因，198个在脑梗死疾病中表达上调，5个在脑梗死疾病中表达下调，可作为诊断及治疗的潜在靶点。PPI网络及Degree、Betweenness、Closeness算法拓扑分析结果显示，PI3KCA、MAPK1、EGFR等48个靶点相互作用最强，可作为后续基础研究验证方向。GO、KEGG富集分析结果显示，BP共富集354个生物进程，CC共富集16个细胞组分，MF共富集29个分子功能，KEGG共富集137个信号通路，结合FDR、ratio与P值结果对富集分析结果进行权重分析，进一步聚焦其富集结果。结论：化痰通络汤可针对性上调GFAP、CD14、STAT3、H19、CXCL16等，下调NAT8F3、OLR59、GPR88等，以多组分、多功能、多途径的形式介导鞘脂信号通路、VEGF通路、HIF-1通路等多通路在脑梗死风痰阻络证中发挥作用。
关键词 基因表达综合;差异基因;化痰通络汤;脑梗死;网络药理学;风痰阻络证;KEGG富集分析;靶点
Study on the Mechanism of Huatan Tongluo Decoction in the Treatment of Cerebral Infarction Based on GEO Data Mining and Network Pharmacology
GONG Cuilan1，ZHOU Desheng2，YANG Renyi3，FU Xinying3
（1 The Changde Hospital of Hunan University of Chinese Medicine，Changde 451000，China; 2 The First Hospital of Hunan University of Chinese Medicine，Changsha 410007，China; 3 Hunan University of Chinese Medicine，Changsha 410208，China）
Abstract Objective：To analyze the disease genes of cerebral infarction by GEO chip data and network pharmacology methods，and to explore the mechanism of Huatan Tongluo Decoction in the treatment of cerebral infarction with the syndrome of wind-phlegm obstructing collaterals，so as to provide theoretical basis for the prevention and treatment of cerebral infarction with traditional Chinese medicine（TCM）.Methods：Interdisciplinary methods were used to study the treatment of Huatan Tongluo Decoction for syndrome of wind-phlegm obstructing collaterals of cerebral infarction.The database resources of GEO，GeneCards，TCMSP，PubChem，Swiss Target Prediction，String and WebGestalt were integrated，and the differential genes of cerebral infarction，disease targets，effective components and targets of Huatan Tongluo Decoction were screened by Cytoscape and R language software.From the point of view of PPI co-expression network，GO and KEGG enrichment analysis，the mechanism of Huatan Tongluo Decoction in treating cerebral infarction with syndrome of wind-phlegm obstructing collaterals was explored tentatively.Results：A total of 3 110 targets of for cerebral infarction diseases were obtained， of which there were 203 differential genes. There were 198 up-regulated in cerebral infarction diseases， and there were 5 down-regulated in cerebral infarction diseases， which can be used as potential targets for diagnosis and treatment.The topology analysis results of PPI network，Degree，Betweenness，and Closeness algorithms showed that 48 targets such as PI3KCA，MAPK1 and EGFR interacted most strongly，which can be used as the direction of follow-up basic research.The results of GO and KEGG enrichment analysis showed that BP enriched 354 life processes，CC enriched 16 cell components，MF enriched 29 Molecular functions，and KEGG enriched 137 signal pathways.Combined with the results of FDR，ratio and P value，the weight analysis results were analyzed to further focus on the enrichment results.Conclusion：Huatan Tongluo Decoction could up-regulate/down-regulate target genes（up-regulated GFAP，CD14，STAT3，H19，CXCL16，etc. and down-regulate NAT8F3，OLR59，GPR88，etc.）in the form of multi-component，multi-function and multi-pathway，mediate sphingolipid signal pathway，VEGF pathway，HIF-1 pathway and other pathways were playing a roles in the syndrome of wind-phlegm obstructing collaterals in cerebral infarction.
Keywords Gene Expression Omnibus; Differential gene; Huatan Tongluo Decoction; Cerebral infarction; Network pharmacology; Syndrome of wind phlegm obstructing collaterals; KEGG enrichment analysis; Target
中图分类号：R255.2;R743.3文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.09.010
脑梗死属中医“缺血中风”范畴，是临床常见病、多发病，具有高致残率、致死率的特点，严重危害人类健康，因此脑梗死的中医药防治具有重要意义[1]。《中国脑梗死中西医结合诊治指南（2017）》指出[2]，脑梗死中经络期风痰阻络证者，以突发半身不遂、偏身麻木、痰多而黏，脉弦等症状为主要表现，以熄风化痰、活血通络之法，方用化痰通络汤治之。本研究整合GEO芯片数据，结合网络药理学模式，探讨脑梗死疾病潜在靶点，并对治疗缺血中风风痰阻络证的化痰通络汤进行初步的机制分析，为中医药防治脑梗死提供理论和实践依据[3]。
1 材料与方法
1.1 腦梗死疾病靶点筛选 利用基因表达综合（Gene Expression Omnibus，GEO）数据库（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/），以“Cerebral infarction”为检索词，获取GSE97537数据集，下载MCAO与Sham组芯片数据，即MCAO组（GSM2571735、GSM2571736、GSM2571737、GSM2571738、GSM2571739、GSM2571740、GSM2571741）共7组;Sham组（GSM2571742、GSM2571743、GSM2571744、GSM2571745、GSM2571746）共5组。
采用R语言对下载的GSE97537数据集表达矩阵进行质量控制，绘制箱式图及主成分分析图;采用limma包对表达矩阵进行差异性分析，logFC≥1与adj.P.Val<0.05为差异基因筛选条件，以筛选出脑梗死疾病差异基因，并绘制火山图与前50位热图。同时整合通过GeneCards（https：//www.genecards.org/）数据库中“Cerebral infarction”为检索词的脑梗死疾病相关靶点，与脑梗死疾病差异基因取并集，得到脑梗死疾病靶点。
1.2 化痰通络汤潜在药物靶点筛选 化痰通络汤有效成分及结构式收集：1）采用中药系统药理学数据库与分析平台（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP）（http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）数据库[4]，以药代动力学ADMT参数中，口服生物利用度（Oral Bioavailability，OB）≥30%，药物类药性（Drug Likeness，DL）≥0.18为条件[5]，获取茯苓、半夏、白术、天麻、天南星、天竺黄、丹参、香附、大黄、三七10味中药有效成分。2）采用PubChem[6]（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）数据库收集各有效成分SDF结构式。
化痰通络汤潜在药物靶点收集：采用Swiss Target Prediction（http：//www.swisstargetprediction.ch/）数据库[7]，将有效成分结构式导入数据库，获取化痰通络汤潜在药物靶点。
1.3 共同靶点筛选及蛋白质-蛋白质相互作用（Protein Protein Interaction，PPI）网络构建 将1.1中的脑梗死疾病靶点（简称：疾病靶点）与1.2中化痰通络汤潜在药物靶点（简称：药物靶点）利用EXCEL取交集，并绘制韦恩图，获取化痰通络汤治疗脑梗死的共同靶点。
利用String[8]（https：//string-db.org/）数据库，将共同靶点导入数据库，获取PPI相关信息。利用Cytoscape软件对PPI信息进行网络可视化，并对PPI网络进行Degree、Betweenness、Closeness算法拓扑分析。对PPI网络Degree、Betweenness、Closeness算法拓扑分析的靶点进行整合，采用EXCEL去除重复值保留唯一值，以获取拓扑分析靶点。
1.4 拓扑分析靶点GO和KEGG富集分析 利用WebGestalt[9]（http：//www.webgestalt.org/#）数据库，采用ORA算法，将拓扑分析靶点导入，进行GO、KEGG富集分析，收集生物进程（Biological Process，BP）、细胞组分（Cellular Component，CC）、分子功能（Molecular Function，MF）及KEGG富集分析数据，同时进行权重分析，并绘制火山图。
2 结果
2.1 脑梗死疾病靶点筛选结果 利用GEO数据库，获取GSE97537数据集，采用R语言affyPLM与limma包对GSE97537进行归一化与差异分析，并绘制数据归一化箱数图（图1A）、GSE97537各组主成分分析图（PCA，图1B）、差异基因火山图（图1C）及前50位差异基因热图（图1D）。归一化及PCA结果显示GSE97537数据集中各数据处于同一数量级，可进行综合分析。火山图及热图结果中，筛选出脑梗死疾病差异基因共203个，其中198个差异基因在脑梗死疾病中表达上调（如CCL2、HSPB1、HSPA1A等）;5个差异基因在脑梗死疾病中表达下调（如NAT8F3、GPR88、SYNDIG1L等）。
为进一步补充脑梗死疾病靶点，检索并整合GeneCards数据库中脑梗死疾病相关靶点，共检索出脑梗死疾病相关靶点3 110个，并与脑梗死疾病差异基因取并集，去除重复值保留唯一值后，最终获得脑梗死疾病靶点3 218个，其中有95个（图2A）为GEO数据挖掘的脑梗死差异基因与GeneCards数据库中脑梗死疾病相关靶点的重复靶点（如IL6、IL1B、FGF2等）。
2.2 化痰通络汤潜在药物靶点筛选结果 利用TCMSP数据库，根据OB≥30%，DL≥0.18为初筛条件，获取10味中药有效成分，其中茯苓15个（如pachymic acid、trametenolic acid、ergosta-7，22E-dien-3beta-ol等）;半夏13个（如24-Ethylcholest-4-en-3-one、Cavidine、baicalein等）;白术7个（如12-senecioyl-2E，8E，10E-atractylentriol、α-Amyrin、3β-acetoxyatractylone等）;天麻21个（如Vanillin、Succinic Acid、Gastrodamine等）;天南星7个（如8，11，14-Docosatrienoic acid，methyl ester、24-epicampesterol、beta-sitosterol等）;天竺黄无;丹参65个（如6-o-syringyl-8-o-acetyl shanzhiside methyl ester、Baicalin、digallate等）;香附18个（如Chryseriol、isorhamnetin、8-Isopentenyl-kaempferol等）;大黄16个[如：Toralactone、aloe-emodin、（-）-catechin等];三七8个（如Mandenol、Stigmasterol、ginsenoside f2等）。采用PubChem数据库收集上述有效成分SDF结构式。
利用Swiss Target Prediction数据库预测化痰通络汤潜在药物靶点，去除重复值保留唯一值后，共获取824个化痰通络汤药物潜在靶点（如PTGES、VEGFA、STAT1等）。
2.3 共同靶点筛选结果及PPI网络构建 将3 218个脑梗死疾病靶点与824个化痰通络汤药物靶点利用EXCEL取交集，并绘制韦恩图（图2A），获取化痰通络汤治疗脑梗死的共同靶点共463个（如STAT3、IL6、JUN等）。
将463个共同靶点导入String数据库，获取PPI相关信息，利用Cytoscape软件对PPI信息进行网络可视化（图2B），并对PPI网络进行Degree、Betweenness、Closeness算法拓扑分析，并进行可视化（图2C、D、E）。PPI网络中，有463个节点，4 322条边，P<1.0e-16，其中大红色为50≤Degree≤84;蓝色为30≤Degree值<50;粉红色为1≤Degree值<30，选取PPI网络中前30位的Degree、Betweenness、Closeness算法拓扑分析结果。见表1。将PPI网络Degree、Betweenness、Closeness算法拓扑分析的前30位靶点进行整合，获得拓扑分析靶点共48个（如PI3KCA、MAPK1、EGFR等），可作为后续重点实验验证对象。
2.4 拓扑分析靶点GO和KEGG富集分析 BP共富集354个生物进程，结合FDR、ratio与P值结果权重分析，并绘制火山图（图3A），主要富集于促进细胞运动、循环系统过程、免疫应答调节途径、二价无机阳离子稳态、肽苏氨酸修饰与脂质代谢过程的调节等生物进程。
CC共富集16个细胞组分，结合FDR、ratio与P值结果权重分析，并绘制火山图（图3B），主要富集于膜区、囊泡腔、谷氨酸能突触、富含ficolin-1的颗粒、膜面、轴突部分、膜的外在成分等细胞组分。
MF共富集29个细胞功能，结合FDR、ratio与P值结果权重分析，并绘制火山图（图3C），主要富集于G蛋白偶联受体结合、磷脂酰肌醇双磷酸激酶活性、蛋白质丝氨酸/苏氨酸激酶活性、RNA聚合酶Ⅱ转录因子结合等细胞功能。
KEGG共富集137个信号通路，结合FDR、ratio与P值结果权重分析，并绘制火山图（图3D），主要富集于鞘脂信号通路、VEGF信号通路、C型凝集素受体信号通路、神经营养蛋白信号通路、cAMP信号通路、HIF-1信号通路、TRP通道的炎症介质调节通路。
3 讨论
脑梗死具有高致残率、高死亡率的特点，是常见病、多发病。脑梗死属“缺血中风”，病因不外乎风、火、痰、瘀、虚、气、血六端，病机总属本虚标实，以气血亏虚、肝肾阴虚为本，风火痰瘀为标[10]。中风风痰阻络之证，肝脾肾虚，精微气血不足或运化无力，聚湿成痰，痰湿内停，瘀血内生，痰瘀阻滞脑络，发为中风，治疗上当以熄风化痰、活血通络之化痰通络汤治之。随着高通量测序及计算机算法的发展，基于芯片数据及网络药理学的方法，初步探讨化痰通络汤治疗脑梗死风痰阻络证的作用机制，为实验研究提供方向，为临床研究提供理论基础，为中医药防治脑梗死提供实践依据。
本研究利用GEO、GeneCards数据库筛选出脑梗死差异基因与疾病基因，为脑梗死的诊断及防治提供了精准靶点;同时利用TCMSP、PubChem、Swiss Target Prediction数据库筛选出化痰通络汤有效成分及其治疗靶点，为化痰通络汤治疗脑梗死风痰阻络证提供了靶点依据;最后对疾病靶点与中药靶点综合分析，筛选出化痰通络汤治疗脑梗死风痰阻络证的可能靶点，并采用String、WebGestalt数据库对靶点进行PPI网络分析和GO、KEGG富集分析，为进一步明确作用机制提供了理论方向。
本研究通过GEO数据库共筛选出203个脑梗死差异基因，其中CCL2、HSPB1、GSPB1、GFAP、CD14、STAT3、H19、CXCL16等198個基因表达上调;NAT8F3、OLR59、GPR88、PAMR1、SYNDIG1L 5个基因表达下调;GeneCards数据库共筛选3 110个脑梗死相关靶点，涵盖IL6[11]、GFAP[12]、TNF[13]、IL1B[14]、JUN[15]等95个差异基因，其中有大部分被文献报道，在脑梗死疾病中异常表达，可作为脑梗死诊断治疗的潜在靶点。Li等[11]研究发现鸢尾素可降低脑梗死小鼠TNF-1α、IL-6水平，抑制IL-1β的活化，激活Akt/ERK1信号通路，减少缺血区神经元损伤;团队前期发现活血荣络方下调JAK2、STAT3表达，减轻大鼠脑缺血再灌注损伤炎症反应，对神经元起到保护作用[16]。因此基于GEO、GeneCards数据库筛选的脑梗死疾病基因，可作为脑梗死诊断、精准治疗的靶点基因，为临床及机制研究提供了理论依据。
中风之风痰阻络证者，偏食肥甘醇酒之类，脾失键运，湿痰内生;或逸多劳少，形体肥重，痰湿气虚，痰湿聚集，肝阳化风，风痰夹湿，阻滞脉络，上扰清窍，则见眩晕头疼、手足麻木、半身不遂、口角歪斜等症，当以化痰通络汤加减治之。化痰通络汤[17]以化痰逐瘀、祛风通络为治法，由茯苓、半夏、生白术、天麻、天南星、天竺黄、丹参、香附、大黄、三七等组成，其中，半夏燥湿化痰，香附理气和中，二者为君药合用，增强燥湿化痰之力，体现治痰先理气，气顺则痰消之意;天南星、天竺黄清热化痰，既助半夏化痰，又熄风定惊;大黄通腑泻热、凉血逐瘀，使腑气畅通而痰火得以清化;丹参、三七行气、活血化瘀，此四味共为臣药;天麻熄风定眩，为佐药;生白术、茯苓健脾利湿，健脾以杜生痰之源，利湿以助化痰之力，为使药。综合全方，温凉兼进，共奏化痰祛瘀、熄风通络之良效。为进一步探讨化痰通络汤在脑梗死中医药防治中的作用机制，本研究采用网络药理学的方法，利用TCMSP、Pubchem、Swiss Target Prediction、String、WebGestalt数据库，获取化痰通络汤各中药有效成分、结构式及824个药物潜在靶点;同时对化痰通络汤治疗脑梗死的共同靶点进行PPI共表达网络分析，其中PIK3CA、PIK3R1、APP、MAPK1、STAT3、VEGFA、MMP、AKT等PPI效果显著，在化痰通络汤治疗脑梗死中发挥重要作用。研究发现化痰通络汤能上调脑梗死患者血清VEGF水平，改善神经功能[18];也能抑制脑梗死大鼠MMP9的表达[19]，明显改善大鼠神经功能。研究证实，有效成分黄芩素（Baicalein）能通过降低核因子κB的IκBα磷酸化与p65的核转位，减少炎症介质IL-6、IL-18释放;还能降低LC3-Ⅱ/LC3-1比值，促进PI3K/Akt/mTOR通路磷酸化，抑制自噬，从而减轻缺血再灌注大鼠神经炎症、细胞自噬，对脑梗死损伤发挥神经保护作用[20]。因此化痰通络汤及其有效成分可能主要通过PPI方式，以共表达网络形式影响脑梗死疾病蛋白（如PI3K、VEGF、STAT3、MMP等）表达，从而发挥脑保护作用。
WebGestalt数据库拓扑分析靶点GO、KEGG富集分析结果显示，化痰通络汤能多靶点、多成分、多途径、多通路治疗脑梗死疾病，主要在膜区、囊泡腔区，通过G蛋白偶联受体结合、DNA转录因子模式，促进细胞运动、促进循环、促进免疫应答进程，介导鞘脂信号通路、VEGF通路、HIF-1通路发挥抗脑梗死疾病的作用。研究发现化痰通络汤可激活VEGF通路，上调VEGF、CD31表达，从而促脑梗死后血管新生[21];香草醛（Vanillin）是化痰通络汤有效成分，可通过G蛋白偶联受体结合方式，在血脑屏障区，上调ZO-1、occludin、Claudin-5表达，阻断MMP-9活化，减轻氧化应激和保持血脑屏障完整性，从而发挥脑保护作用[22]。
综上所述，本研究整合多个数据库资源，初步筛选出上调/下调差异基因，同时筛选出化痰通络汤药物的有效成分及治疗靶点，最后通过共表达网络及富集分析得出，化痰通絡汤可针对性上调/下调靶点基因（上调GFAP、CD14、STAT3、H19、CXCL16等，下调NAT8F3、OLR59、GPR88等），以多组分、多功能、多途径的形式，介导鞘脂信号通路、VEGF通路、HIF-1通路等多通路在脑梗死风痰阻络证中发挥作用，为该方的临床进一步推广应用及深入研究奠定了科学基础。
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（2020-04-10收稿 责任编辑：芮莉莉）
