基于气相色谱-质谱联用的抗结核药致肾损伤代谢组学及谷胱甘肽治疗作用研究

    彭琳秀 谢彤 单进军

    

    

    

    摘?要?以异烟肼（INH，100 mg/（kg·d，ig））和RIF（RIF，100 mg/（kg·d，ig））为模型药物，连续灌胃14天诱导建立抗结核药大鼠肾损伤模型，以组织病理学、血清生化指标（尿素氮、肌酐）为考察对象，观察抗结核药物引起的肾损伤严重程度; 采用基于气相色谱-质谱联用的代谢组学技术结合偏最小二乘法-判别分析等多维、单维统计方法探讨INH联用RIF对大鼠肾组织中内源性小分子化合物的代谢影响。采用对抗结核药物引起的组织细胞损伤具有保护作用的谷胱甘肽（GSH，250 mg/（kg·d，iv）对大鼠进行干预治疗，从代谢调控的角度阐明GSH发挥保肾的作用机制。组织病理学及血清生化结果显示，大鼠给予INH和RIF后，血清中尿素氮和肌酐水平显著升高（p<0.05），肾小管上皮中度空泡变性，提示肾组织出现损伤。代谢组学数据提示，结核药物联用导致了大鼠肾组织中酪氨酸、脯氨酸、尿苷、棕榈油酸等31个内源性物质代谢紊乱; 主要导致了大鼠脂肪酸代谢、精氨酸和脯氨酸代谢异常。GSH能降低大鼠血清中尿素氮的水平（p<0.05），减轻大鼠肾小球系膜的增生情况; GSH能够通过调控肾组织中棕榈油酸、4-羟基丁酸、瓜氨酸、葡糖酸内酯、胍基乙酸和哌啶酸的代谢水平有效改善抗结核药物引起的大鼠肾组织损伤。

    关键词?抗结核药; 肾损伤; 谷胱甘肽; 代谢组学; 气相色谱-质谱联用

    1?引 言

    结核病是由结核杆菌引起的一种慢性传染病。根据世界卫生组织的《全球结核病报告》，2016年全球约有1040万新发结核病病例，130万人死于该病[1]。异烟肼（Isoniazid，INH）[2]和利福平（Rifampicin，RIF）[3]均是WHO推荐的一线抗结核药物，常联合使用，用于治疗结核病。然而，临床研究发现，INH和RIF联合使用可导致患者出现药物性肝损伤症状[4，5]。INH的毒性代谢产物肼会引起不可逆的肝细胞损伤和炎症[6]; RIF能够使肝脏出现坏死斑点，甚至出现弥漫性的坏死带，肝脏细胞伴有脂肪变性现象[7]。有文献报道，使用INH和RIF会造成肾组织损伤[8，9]，但其致损机制未见报道。

    代谢组学通过研究生物体对病理生理刺激或基因修饰产生的代谢物的质和量的动态变化表征机体受影响程度[10～12]，其作为评价药物安全性的有效手段在毒理学研究中得到广泛应用。Zhao等[13]基于非靶标代谢组学研究发现三羧酸循环代谢紊乱是马兜铃酸引发机体肾毒性的重要代谢特征; Xia等[14]对小鼠肾组织中内源性代谢物进行检测，揭示了顺铂诱导肾脏损伤与干扰脂质代谢和氨基酸代谢有关; 此外，某些中药药对的配伍减毒机制也在代谢层面得到了科学论证[15]。采用代谢组学技术进行药物肾毒性监控，有助于寻找特异性的毒性生物标志物、确定药物的毒性机制，对指导临床用药意义重大。然而，目前未见采用代谢组学技术研究联合使用INH和RIF致肾损伤的机制的报道。

    本研究以“INH+RIF”为模型药物，建立了抗结核药大鼠肾损伤模型，同时采用对机体急性肾损伤具有保护作用的谷胱甘肽[16，17]进行干预治疗，基于气相色谱-质谱联用（GC-MS）的代谢组学技术，研究大鼠在使用抗结核药物后肾组织中内源性代谢物的变化特征，结合组织病理学检查及生化指标分析，揭示INH和RIF联用致大鼠肾损伤机制以及评价谷胱甘肽（Glutathione，GSH）的治療效果。

    2?实验部分

    2.1?仪器与试剂

    Trace1310-TSQ8000Evo三重四极杆气相色谱-质谱联用仪、Savant SPD1010 真空离心浓缩仪（美国Thermo Scientific公司）; Allegra64R高速冷冻离心机（美国Beckman公司）; Vortex-Genie 2涡旋振荡器（美国Scientific industries公司）; CPA225D型电子天平（德国Sartorius公司）; THZ-C恒温振荡仪（太仓市强乐实验设备有限公司）。

    异烟肼片（批号：1612051）和利福平胶囊（批号：1710011）（沈阳红旗制药有限公司）; 注射用还原型GSH（批号：0811020，重庆药友制药有限公司提供）。羧甲基纤维素钠（CMC-Na，批号：20161015，成都市科龙化工试剂厂）; 甲氧基胺盐酸盐（98%）、吡啶（99.8%）、N-O-双（三甲硅基）三氟乙酰胺（BSTFA，98.5%）、 1，2-13C肉豆蔻酸（99%）均购于美国Sigma-Aldrich公司; 甲醇购于美国Merck公司; 实验用水为超纯水。

    2.2?实验方法

    2.2.1?药物配制?取适量异烟肼片研磨成细粉，用0.5% CMC-Na溶液溶解，配制成5 mg/mL的INH混悬液; 取适量利福平胶囊内容物，加0.5% CMC-Na溶液溶解，配制成5 mg/mL的RIF混悬液。

    2.2.2?动物模型制备及给药方案?28只SPF级雄性Wistar大鼠（180～220 g），购于北京维通利华实验动物有限公司，许可证号：SCXK（沪）2015-0007，实验遵循南京中医药大学实验动物饲养原则。实验前，大鼠置于相对温度为（22±2）℃、相对湿度为45%～60%、12 h昼夜循环的环境中适应性饲养5天，自由饮食，饮水。

    将28只Wistar大鼠随机分为空白对照组（Control，n=10）、模型组（Model，n=10）和GSH干预组（GSH，n=8）。模型组和GSH干预组大鼠于第1天同时分别灌胃给予INH（100 mg/（kg·d））、RIF（100 mg/（kg·d），每天一次，连续灌胃14天，用于制备大鼠肾损伤模型。空白对照组灌胃给予等体积0.5% CMC-Na溶液（10 mL/（kg·d））作为空白对照。同时，从造模第1天起至第14天，GSH干预组大鼠尾静脉注射还原型GSH（250 mg/（kg·d））; 空白对照组和模型组尾静脉注射等体积生理盐水。

    2.2.3?样本收集及前处理?末次给药2 h后，采集大鼠腹主动脉血液，血液样本在室温静置1 h后分离血清，用于测定尿素氮和肌酐的水平。取大鼠同一部位的肾脏组织固定于福尔马林中，进行HE染色，分析组织病变情况。同时，采集大鼠肾组织样本，立即置于液氮中淬灭，再置于80℃保存，用于代谢组学分析。

    称取20 mg肾组织，加入0.2 mL水研磨，取50 μL匀浆液置于含有10 μL 1，2-13C 肉豆蔻酸内标溶液的1.5 mL EP管中，加入200 μL甲醇，涡旋混匀后离心，取100 μL上清液置于另一个干净EP管中，并放置于离心浓缩仪中挥干。向挥干后的样本中加入30 μL 10 mg/mL甲氧胺吡啶溶液，涡旋5 min后置于恒温振荡仪中振荡1.5 h，加入30 μL BSTFA（含1% TMS），混匀，振荡0.5 h。衍生化后的样本在4℃以18000 r/min离心10 min，吸取上清液，进样分析。

    实验过程中，为评估实验操作误差及仪器系统稳定性，通过将各样本肾组织匀浆液等量混合，制备质量控制样本（QC），同其它实验样本平行操作，进行样本前处理。

    2.2.4?GC-MS分析条件?色谱柱： TG-5MS毛细管色谱柱（30 m × 0.25 mm，0.25 μm，Thermo公司）; 载气： 高纯氦气（纯度>99.999 %）; 气流速度： 1.2 mL/min; 进样量： 1 μL; 分流比： 20∶1; 升温程序： 0～1 min，60℃; 1～14 min，60～320℃; 14～19 min，320℃。质谱电离方式： 电子电离源（EI）; 电离能量： 70 eV; 传输线温度： 250℃; 离子源温度： 280℃; 采用全扫描，扫描范围： 50～500 m/z。采用GC-MS分析样本前先进5针QC以平衡系统，之后每进10针实验样本后进1针QC样本，以监控及考察仪器稳定性。此外，进样前后采用GC-MS分析饱和脂肪酸甲酯混合标准品溶液（C8，C9，C10～C30的偶数碳链），计算保留指数，辅助代谢物定性分析。

    2.2.5?数据处理?原始GC-MS文件，经Abf Converter转换格式后，导入MS-DIAL数据处理软件进行数据预处理，处理过程包括峰提取、物质鉴定、峰对齐等。提取得到的色谱峰根据保留指数和碎片离子峰与FiehnLib数据库[18]进行代谢物匹配，相似度>80%的代谢物将和NIST库进行碎片离子峰匹配，以验证代谢物鉴定的准确性。最终得到包含样本名称、代谢物信息（包含代谢物名称、保留时间及质荷比信息）及峰高值的三维矩阵数据集。矩阵数据经Loess和Pareto scaling归一化后采用MetaboAnalyst 4.0在线网站进行偏最小二乘法-判别分析（PLS-DA）及正交偏最小二乘法-判别分析（OPLS-DA）。经Loess校准后的数据采用基于One-way ANOVA的非参数检验，即Kruskal-Wallis 检验进行多组间及两两组间差异性比较。模型组与空白对照组及GSH干预组分别比较，当代谢物满足组间两两比较Fold change>1.2或<0.83且p<0.05时，提示此物质为组间差异性代谢物。

    3?结果与讨论

    3.1?組织病理学及生化指标分析

    肾组织HE染色结果显示，与空白对照组相比，模型组大鼠出现明显的肾损伤，其肾小管上皮中度空泡变性，部分大鼠肾小球系膜出现轻度增生，但未见坏死或萎缩。与模型组比较，采用GSH干预的大鼠肾组织炎症症状减轻（图1A～1C）。为研究INH和RIF联用致大鼠肾损伤情况及评价GSH的治疗作用，分析比较了各组大鼠血清肌酐（CREA）和尿素氮（BUN）的差异。与空白对照组相比，模型组大鼠血清中CREA和BUN的含量显著升高。CREA是肌肉在体内的代谢产物，主要由肾小球滤过排出体外，当肾功能不全时，CREA在体内蓄积成为对人体有害的毒素。BUN是血浆中除蛋白质以外的一种含氮化合物，能经肾小球滤过排出体外，BUN的异常升高提示肾小球滤过功能受损。上述研究结果均提示，大鼠给予INH和RIF后出现了严重的肾脏损伤，GSH能够通过调节大鼠血清中BUN水平而发挥疗效。

    3.2?肾组织非靶标代谢轮廓分析

    GC-MS技术常用于分析挥发性化合物，多数难挥发性的化合物通过衍生化处理也可被检测到。从大鼠肾组织中鉴定得到包含氨基酸、脂肪酸和嘌呤等121个小分子化合物，大鼠肾组织样本总离子流图及部分代谢物碎片峰与NIST库对比图见图2。将得到的矩阵数据经Loess归一化后绘制实验样本与QC样本的PCA得分图（图3A），蓝色点表示QC样本，QC样本聚集于95%的置信区间; 同时计算各代谢物在QC样本中的峰高的RSD值，多数物质在QC样本中的变异度小于20%（图3B），表明实验操作及仪器稳定，数据可靠。采用PLS-DA分析大鼠给予INH和RIF后肾组织内的代谢物的变化趋势（图4A），PLS-DA图中每个点代表一个样本，样本间距离越小表示其代谢状态越相似。对模型进行置换检验，判断模型是否过拟合，结果显示p<0.05（图4B），表明模型稳定可靠。直观地分析PLS-DA图可知，空白对照组与模型组及GSH干预组均区分比较明显，GSH干预组的样本在图上更接近于空白对照组，GSH具有调节代谢轮廓向空白对照组逆转的趋势，说明GSH干预后能促进差异性小分子代谢物向正常水平回调。对3组大鼠代谢轮廓两两进行OPLS-DA分析，GSH组与模型组亦区分较好，GSH的使用显著调控了药物性肾损伤大鼠体内的小分子内源性物质。

    模式判别分析结果表明，INH和RIF联用对大鼠肾组织代谢产生了显著影响，结合生化指标分析结果，推测抗结核药物导致了大鼠肾组织功能受损，影响了机体代谢。GSH对肾组织中内源性代谢物有显著的调控作用，但是，对产生影响的内源性代谢物进行筛选则需要以组别为单变量进行统计分析。

    3.3?差异性代谢物及代谢通路分析

    将空白对照组、GSH干预组分别与模型组两两比较进行统计分析，以p1.2或<0.83为筛选标准，筛选得到由于药物性肾损伤或GSH干预产生的差异性代谢物。抗结核药物导致了大鼠肾组织中31种内源性代谢物发生变化，GSH对其中12种代谢物有调控作用。

    将筛选得到的差异性代谢物进行富集分析，绘制INH和RIF联用对机体造成干扰的代谢通路（见图5），每种代谢物旁的表格标注了该代谢物在各组间的变化趋势，以棕榈油酸为例，与空白对照组相比，模型组肾组织中的棕榈油酸显著上调，GSH作用后，肾组织中棕榈油酸的代谢水平下调。结合表1可知，抗结核药物的联用主要导致了机体内精氨酸和脯氨酸代谢、脂肪酸合成异常。

    由图5和表1可知，从肾组织中筛选出多种饱和及不饱和脂肪酸（油酸、亚油酸、棕榈油酸和花生酸等），与抗结核药物的使用有关，说明肾组织合成脂肪酸的功能受损。多烯不饱和脂肪酸会与自由基反应，造成脂质过氧化[19]，抗结核药物联用造成多种不饱和脂肪酸代谢水平升高，提示脂质过氧化的形成。研究表明，当组织受到毒性损害时，可诱导生成大量自由基，引起过氧化损伤，加快GSH消耗或使其合成受到抑制，因此，外源性补充还原型GSH可有效弥补机体GSH代谢不足[20]。

    肾脏内富含氨基酸分解代谢所需的酶，在氨基酸体内平衡中起重要作用。组织中多个氨基酸水平发生变化，反映了蛋白质代谢异常，表明肾功能受损。蛋氨酸，亦称甲硫氨酸，是参与蛋白质合成的必需氨基酸，甲硫氨酸缺乏会导致蛋白质合成受阻。与空白对照组相比，模型组大鼠肾组织中的甲硫氨酸含量显著上调; 生物体处于氧化应激状态下产生的活性氧能将甲硫氨酸残留物氧化成甲硫氨酸亚砜，后者在甲硫氨酸还原酶作用下还原成甲硫氨酸，因此甲硫氨酸残基可作为清除活性氧的抗氧化剂。GSH是甲硫氨酸的代谢产物，还原型GSH能促进体内氧自由基清除，避免活性氧和氧自由基产生过氧化脂质，导致组织过氧化损伤[19]。INH在体内经代谢产生的毒性产物肼易引发氧化应激，从而导致线粒体损伤。线粒体是机体进行氧化代谢的部位，是糖类、脂肪、氨基酸代谢释放能量的场所[21]。本研究中，肾损伤大鼠肾组织中葡萄糖、乳酸、葡萄糖酸内酯、磷酸的含量较空白對照组降低，表明葡萄糖等在INH和RIF联用引起的肾损伤中作为能量物质利用率增加。GSH作为一种重要的代谢调节物，能激活巯基酶、辅酶等多种酶，从而促进糖类、脂肪及蛋白质代谢。本研究中，GSH主要调控了葡糖酸内酯的代谢[22]。

    精氨酸是尿素循环过程中的核心物质，是合成一氧化氮（NO）的唯一底物，参与免疫和血管张力调节。在肾脏中，NO主要扩张入球小动脉，增加肾小球血流灌注。本研究中，精氨酸的多个下游代谢产物（瓜氨酸、脯氨酸、胍乙酸）出现代谢异常。近年的研究表明，精氨酸在机体代谢过程中发挥了重要作用，哺乳动物补充精氨酸有利于维持肠道微生态平衡，修复肠黏膜损伤[23]。精氨酸的合成基本发生在小肠上皮细胞，上皮细胞会吸收谷氨酰胺及谷氨酸代谢产生瓜氨酸，再在肾小管细胞协助下抽取出来转化为精氨酸。 因此，肾脏受到损害时，精氨酸相关代谢物会受到干扰。胍乙酸由精氨酸在L-精氨酸-甘氨酸氨基转移酶的作用下合成，而胍乙酸可在胍基乙酸甲基转移酶作用下，结合甲硫氨酸提供的甲基而转化成肌酸。肾脏中生成的胍乙酸和肌酸水平降低反映了肾脏损伤造成的肾脏合成功能降低[24]。由图6可见，GSH显著回调了精氨酸代谢通路中瓜氨酸和胍基乙酸的代谢水平。

    4?结 论

    通过组织病理学观察和血清生化指标的结果发现，INH和RIF联用会造成大鼠肾组织严重损伤。采用基于GC-MS的非靶标代谢组学分析方法，从生物体代谢状态的角度全面分析比较了药物性肾损伤大鼠内源性代谢物的扰动程度。INH联用 RIF导致了大鼠肾组织中31种内源性物质的代谢水平发生变化，对肾组织代谢产生了较为显著的影响，兼具抗氧化作用和解毒作用的GSH有效缓解了大鼠肾损伤的状况，并通过调节肾组织中棕榈油酸等物质的代谢水平发挥疗效。

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