聚L-精氨酸修饰柔性石墨烯平面电极对黄嘌呤的选择性检测

    白志坤 张逸涛 李社红 罗红霞

    

    

    

    摘?要?在聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）的輔助下，将化学气相沉积（CVD）得到的石墨烯从铜基底转移到聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）基底上，制备了柔性石墨烯平面电极（GPE）。通过电化学沉积在GPE表面修饰L-精氨酸（L-Arg），得到聚L-Arg修饰的柔性石墨烯平面电极（P（L-Arg）/GPE）。用扫描电子显微镜（SEM）、能谱法（EDS）和拉曼光谱对此电极进行了表征。用循环伏安法（CV）和微分脉冲伏安法（DPV）研究了P（L-Arg）/GPE对黄嘌呤（XA）的电化学传感作用。在尿酸（UA）和次黄嘌呤（HX）存在下，P（L-Arg）/GPE传感器不仅实现了对XA的选择性测定，而且还成功实现了XA、UA和HX的同时测定，3个氧化峰的峰-峰电位差分别为420和384 mV。XA在0.5～8 μmol/L和8～140 μmol/L浓度范围内，响应电流与XA浓度分段呈良好的线性关系，检出限为0.08 μmol/L（S/N = 3）。此传感器具有稳定性好、重复性强、响应时间短、制作成本低、抗干扰能力强等优点，并成功应用于人血清中XA测定。

    关键词?石墨烯平面电极; 电化学传感; L-精氨酸; 黄嘌呤; 尿酸; 次黄嘌呤

    1?引 言

    黄嘌呤（XA）是一种嘌呤碱，广泛分布在人体和其它生物的器官和体液中，常用作温和的兴奋剂和支气管扩张剂，特别用于治疗哮喘症状。同时，XA也是嘌呤代谢的产物，在黄嘌呤氧化酶的作用下转化为尿酸（UA）。UA是嘌呤在人体中代谢的最终产物。在正常情况下，体内UA的产生和排泄处于相对平衡的状态。体内UA产生过多或排泄机制失衡容易导致体内UA滞留，使人体体液变成酸性，影响人体细胞的正常功能。次黄嘌呤（HX）广泛存在于人体血液、肝脏和尿液中，是嘌呤核苷酸分解代谢的中间产物，也是检测心脏代谢是否异常的重要生化指标之一。在临床诊断中，体液中UA、XA和HX的浓度与多种疾病有关，包括黄嘌呤尿症、痛风、高尿酸血症、肾衰竭和某些先天性代谢疾病[1，2]。准确检测UA、XA和HX对人体代谢系统的稳定性和相关疾病的早期临床诊断具有重要意义。但是，3种嘌呤衍生物通常在人体中同时存在，且涉及HX→XA，XA→UA及其它复杂的转化途径[3]。因此，选择性测定嘌呤代谢中间体XA和同时测定UA、XA和HX在临床检测中具有重要意义。

    目前，检测XA的方法有毛细管电泳法（CE）[4]、气相色谱法[5]、液相色谱法（HPLC）[6]、分光光度法[7]、化学发光法[8]和酶法[9]等。这些方法通常操作复杂，设备和材料昂贵，样品制备严格且耗时较长[10，11]。此外，黄嘌呤氧化酶（XOD）生物传感器重复性和稳定性低，固定流程复杂，容易受温度和pH值的影响[12～14]。因此，开发低成本、高灵敏度和快速响应的非酶电化学传感器十分必要。

    石墨烯是由sp2杂化的碳原子组成的单原子厚度的二维网状结构的碳纳米材料，已广泛用于基础和应用研究中，例如超级电容器、电池和燃料电池等[15，16]。由于石墨烯具有大的比表面积、高的导电性、化学惰性、良好的透明性和机械性能，在电化学传感器领域引起了越来越多的关注[17]。石墨烯可以通过多种技术制备，如化学气相沉积（CVD）法[18]、外延生长法[19]、机械剥离法[20]和氧化还原法[21]等。石墨烯膜修饰电极通常由滴涂石墨烯的均匀分散液或还原氧化石墨烯（GO）制得，但通过这两种方法制备的石墨烯薄膜容易导致石墨烯在电极表面发生团聚且产生较多缺陷，因而无法精确控制修饰电极的薄膜厚度，电极的导电性和重现性不佳[22～24]。

    CVD石墨烯因其具有结构缺陷少、层数可控、电化学性能好等优势，非常适用于电化学传感等的研究，其边缘和基面都具有出色的电催化活性[25]。在本研究组之前的工作中，将 CVD 石墨烯的边缘制备成纳米电极，研究了其对UA、抗坏血酸（AA）和肾上腺素（EP）等生物分子的电催化作用[26]。在此基础上，将金属Cu纳米颗粒电沉积在上述石墨烯纳米电极表面，制备了灵敏的非酶葡萄糖传感器[27]。另一方面，将Cu基底上的 CVD 石墨烯转移到柔性的聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）表面，得到GPE。然后在 GPE 上修饰铁氰化钴纳米颗粒，作为过氧化氢传感器[28]; 修饰L-半胱氨酸，作为多巴胺（DA）和AA传感器[22]; 修饰金铂双纳米粒子和L-半胱氨酸，作为EP传感器[16]。

    L-精氨酸（L-Arg）是维持婴幼儿生长发育的必需氨基酸，是鸟氨酸循环的中间代谢物，能促使氨转变成为尿素，从而降低血氨含量。L-Arg也是精子蛋白的主要成分，有促进精子生成，提供精子运动能量的作用。此外，静注精氨酸，能刺激垂体释放生长激素，可用于垂体功能试验。由L-Arg氧化形成的α-氨基自由基可以连接在电极表面上，进而形成P（L-Arg）聚合物薄膜，用于电化学检测。Wang等[29]构建了基于P（L-Arg）修饰的玻碳电极，实现了DA和EP的同时检测; Cao等[30]制备了基于金纳米颗粒/ P（L-Arg）/多壁碳纳米管复合膜修饰的玻碳电极，构建了酪蛋白电化学免疫传感器。在本工作中，将L-Arg通过电化学方法沉积在GPE表面，构建了柔性聚（L-Arg）/GPE（P（L-Arg）/GPE）。由于CVD石墨烯和L-Arg的协同作用，P（L-Arg）/GPE传感器具有优越的电催化活性，不仅可以独立检测XA，还可以同时检测XA、UA和HX。图1是P（L-Arg）/GPE的制备和检测示意图。

    2?实验部分

    2.1?仪器与试剂

    CHI660D型电化学工作站（上海辰华仪器有限公司），电化学测定采用三电极系统： 工作电极为GPE和P（L-Arg）/GPE，参比电极为Ag/AgCl电极，对电极为铂丝电极; Sartorius PB-10 pH计（德国 Sartorius公司）; 7401F扫描电子显微镜（SEM）和能谱仪（EDS）一体机（日本JEOL公司）; Lab Ram HR Evolution拉曼（Raman）光谱仪 （日本HORIBA公司）。

    Cu基底的少层CVD石墨烯（深圳六碳科技有限公司）; 聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA，Aladdin公司）; PET（厚度為 250 mm，深圳市极致薄膜科技有限公司）; 葡萄糖、NaCl、KCl、柠檬酸盐、AA（国药集团化学试剂有限公司）; L-Arg、L-半胱氨酸、L-甘氨酸、L-苏氨酸、硫脲（美国BIO BASIC公司）; XA、UA、HX（美国Sigma-Aldrich 公司）; 人血清（中国人民大学校医院）。支持电解质为0.1 mol/L PBS缓冲溶液（KH2PO4-Na2HPO4）。所用试剂均为分析纯; 实验用水为超纯水（Millipore公司超纯水仪制备）。

    2.2?实验方法

    2.2.1?转移CVD石墨烯?如图2所示，通过高分子支撑法将Cu基底上的少层CVD石墨烯转移到柔性PET基底上[31，32]。具体步骤如下：将1%（w/w）PMMA的苯甲醚溶液涂在Cu基底CVD石墨烯上，在120℃下干燥5 min; 将PMMA/石墨烯/Cu浸入1 mol/L FeCl3和0.1 mol/L HCl 混合溶液刻蚀掉Cu基底; 将PMMA/石墨烯膜用水洗涤3次，除去过量的Fe3+，并将其转移到PET基底上，在室温下干燥24 h，确保石墨烯完全粘附到PET基底上。将上述薄片浸入丙酮中24 h，除去多余的PMMA，取出后晾干，备用。

    2.2.2?GPE和P（L-Arg）/GPE的制备?用绝缘胶带隔离出0.09 cm2的电极作为有效工作区域，顶部用铜导电胶包裹，制得GPE。将GPE浸入含有2.5 mmol/L L-Arg的溶液中[29]，并在2.2～2.0 V的电位范围内扫循环描15圈，即得到P（L-Arg）/GPE，取出，用水冲洗电极表面，放置备用。

    3?结果与讨论

    3.1?GPE和P（L-Arg）/GPE的表征

    石墨烯在Cu和PET基底上的SEM图如图3A和图3B所示，石墨烯在转移前后都具有良好的完整性和连续性，表明石墨烯成功地转移到PET基底上。经过电化学沉积后，L-Arg以棒状形式存在于GPE上（图3C和3D）。

    图4A是P（L-Arg）/GPE的EDS谱，插图是GPE的EDS谱。由图4A可见，P（L-Arg）/GPE主要由C、N和O元素组成，而GPE仅由C和O元素组成，表明L-Arg成功修饰在GPE上。图4B～4D分别为C、N和O元素的映射图像，与EDS的结果一致。

    采用拉曼光谱表征Cu（a）和PET（b）基底上的CVD石墨烯（图5A）。拉曼光谱中可观察到，在Cu上的石墨烯的3个特征峰：1345 cm1的 D峰，1582 cm1的G峰，2695 cm1的2D峰。其中，D峰可作为评估石墨烯缺陷强度的参数[33]，其峰值越小，代表石墨烯的缺陷越少;而2D和G峰的强度比说明了所用的CVD石墨烯为少层石墨烯[34]。相比于Cu基底，PET上石墨烯的拉曼光谱与之相似，表明在转移过程中CVD石墨烯的结构未被破坏。

    电化学阻抗谱（EIS）是表征电极界面特性的有效方法，EIS谱图中，在高频区的半圆形部分的直径对应于电子传递电阻（Rct）的大小[35，36]，而Rct的数值代表了电极界面电子转移的快慢。图5B是在含有5 mmol/L [Fe（CN）6]3/4和0.1 mol/L KCl混合溶液中得到的GPE和P（L-Arg）/GPE的EIS图谱，GPE和P（L-Arg）/GPE的Rct约为91和22 kΩ。这是因为L-Arg修饰在GPE表面后，由于静电吸附作用，使得[Fe（CN）6]3/4吸附到了电极表面，促进了界面处的电荷转移，从而导致Rct值明显下降。

    3.2?沉积圈数的优化

    采用循环伏安法考察了不同沉积圈数的L-Arg对XA测定的影响。当沉积圈数在5～15范围内依次增加时，XA的氧化峰电流随着沉积圈数的增加而增大。这可能是由于随着沉积圈数的增加，沉积的L-Arg增多，催化活性位点增多。当沉积圈数为15时，P（L-Arg）/GPE对XA有最大的峰电流; 然而，当沉积圈数继续增加到20时，XA的峰电流反而降低，可能是由于L-Arg在电极表面上的过量聚集，阻碍了电子传递。

    3.3?XA在P（L-Arg）/GPE上的电化学响应

    采用循环伏安法进一步研究了XA在GPE和P（L-Arg）/GPE上的电化学响应。图6A为GPE和P（L-Arg）/GPE在不含XA和含有50 μmol/L XA的0.1 mol/L PBS（pH 7.0）中的循环伏安图。修饰前后的电极在空白PBS缓冲溶液中均未显示氧化还原峰（图6A曲线a和b）; 当加入50 μmol/L XA后（图6A曲线c和d），GPE上XA在0.94 V处出现氧化峰，而在P（L-Arg）/GPE上，XA的氧化峰电位正移至0.75 V，且峰电流明显增加，表明修饰L-Arg后的GPE对XA有明显的催化作用。由加入50 μmol/L UA、XA和HX的0.1 mol/L PBS（pH 7.0）中，P（L-Arg）/GPE（曲线b）和GPE（曲线a）的循环伏安曲线（图6B）可知，采用P（L-Arg）/GPE，3种嘌呤衍生物的氧化峰成功分离，且UA-XA和XA-HX之间的峰-峰电位差分别为420和384 mV，表明UA、XA和HX在P（L-Arg）/GPE上可以实现分别和同时测定。

    3.4?扫速的影响

    考察了扫描速度对峰电流的影响。图7A为P（L-Arg）/GPE在含有50 μmol/L XA的0.1 mol/L PBS（pH 7.0）中，扫描速率为25～275 mV/s条件下的循环伏安图。XA的峰电流密度与扫描速度平方根呈线性关系（图7B），线性方程为j （μA/cm2）=0.0767ν1/2（mV/s）1/2 + 0.0126 （R2=0.9944），说明XA在此电极上的氧化反应是受扩散控制的过程。随着扫速增加，XA的氧化电位正向移动。氧化峰电位Epa和扫速对数值（lgν）呈线性关系（图7C），线性回归方程为Epa （V）=0.6522 + 0.048lgv（R2=09964），斜率为2.303RT/αnF（其中，α和n分别代表电子转移系数和转移电子数），当不可逆反应的α=0.5时，XA氧化反应中的转移电子数≈2.45，接近于两电子的转移过程[37]。

    3.5?pH值的影响

    缓冲溶液的pH值通常会对电极上分析物的响应电流和电位产生影响。图8A是P（L-Arg）/GPE在含有50 μmol/L XA的0.1 mol/L PBS中，不同pH值（3.0～8.0）下的循环伏安行为，在pH=5.0、 6.0和7.0时，峰电流密度相近，考虑到人体的生理pH值，后续实验选择pH 7.0（图8B）。XA的Epa随pH值增加而负移（图8C），表明质子直接参与了XA的电化学氧化过程，且Epa和pH值呈线性关系，线性方程为Epa（V）=0.0526 pH + 1.1497 （R2=0.9961），斜率接近理论值59.0 mV/pH，表明XA的氧化过程中涉及相等数量的电子和质子。

    在嘌呤代谢过程中，嘌呤氧化酶将HX转化为XA，再XA转化为UA，这两个过程均为2电子2质子的氧化过程。UA通常在2电子2质子的氧化过程中生成尿酸亚胺化合物[38]。少量的HX在6电子6质子的多步氧化过程中生成尿酸亚胺化合物，或在4电子4质子的多步氧化过程中生成UA。少量的XA也可能对应于4电子4质子的多步氧化过程，生成尿酸亚胺化合物[39]。

    3.6?方法的分析性能

    采用本方法检测不同浓度的XA。如图9A所示，XA的峰电流密度随着浓度的增加而增大。在0.5～8.0 μmol/L和8.0～140.0 μmol/L范围内，XA峰电流密度与浓度分段呈线性关系（图9B），线性方程分别为： j （μA/cm2）=0.0258C （μmol/L） + 0.0355 （R2=0.9948）和j （μA/cm2）=0.0139C （μmol/L） + 0.1611 （R2 = 0.9940）。检出限为0.08 μmol/L（S/N=3）。与其它已报道的黄嘌呤传感器的性能相比较，P（L-Arg）/GPE对XA检测具有检出限低、线性范围较宽等优点（表1）。

    3.7?XA的选择性检测及其与UA和HX的同时检测

    在含有50 μmol/L UA和HX的溶液中，改变XA浓度（10、20、40、60、80、100 μmol/L）得到的微分脉冲伏安图如图10A所示，随着XA浓度增加，其峰电流密度增大，而UA和HX的峰电流密度基本保持不变。在UA和HX存在下，XA峰电流密度与浓度呈良好的线性关系（图10B），P（L-Arg）/GPE电极可以对XA进行选择性检测。

    图11A为P（L-Arg）/GPE在不同浓度UA、XA和HX的0.1 mol/L PBS（pH 7.0）中的电化学响应。由图11B～11D可见，UA、XA和HX的峰电流密度均随着其浓度增加而线性增大，表明利用P（L-Arg）/GPE可同时检测UA、XA和HX。

    3.8?干扰实验

    在最佳实验条件下，研究了P（L-Arg）/GPE作为XA传感器的抗干扰能力。在含有20 μmol/L XA的0.1 mol/L PBS（pH 7.0）中，分别加入10 mmol/L NaCl、 KCl和葡萄糖（Glu）; 2 mmol/L AA、 L -半胱氨酸（L-Cys）、 L-甘氨酸（L-Gly）、 L-苏氨酸（L -Thr）和柠檬酸盐（Cit）;?1 mmol/L硫脲（Thi）。在XA和高浓度干扰物质共存下，其峰电流密度基本保持不变（图12），表明此传感器对XA检测具有良好的选择性和抗干扰性。

    3.9?电极的重现性和稳定性

    利用P（L-Arg）/GPE对 50 μmol/L XA连续循环伏安扫描 30圈后，发现此电极的电流响应仍保持初始值的90%，表明其具有很好的重复性。在相同条件下制备了7根电极，分别对50 μmol/L XA进行检测，响应电流密度的相对标准偏差（RSD）约为4.3%，表明此传感器具有良好的重现性。将此电极在室温下保存30天后，电流仍维持在初始电流的89.9%，表明此电极具有良好的稳定性。

    3.10?实际样品分析

    采用本方法测定了实际血清样品中的XA。用0.1 mol/L PBS将血清稀释100 倍后，采用本方法进行检测。结果如表2所示，加标回收率为98.4%～103.9%，表明P（L-Arg）/GPE可用于人体血清中XA的检测。

    4?结 论

    将 CVD 石墨烯转移到PET 基底上，制备了柔性CVD石墨烯平面电极（GPE），并通过连续CV扫描使L-Arg聚合在GPE的表面，得到聚L-Arg修饰的石墨烯平面电极P（L-Arg）/GPE。研究结果表明，P（L-Arg）/GPE在UA和HX共存下可实现XA的单独测定和三者的同时测定，具有操作简单、成本低、灵敏高度、稳定性和重现性好等优点。此传感器对XA的线性检测范围为0.5～140 μmol/L，检出限为0.08 μmol/L（S/N=3）。此传感器对常见的共存物具有较强的抗干扰性能，因此对XA的检测具有较好的选择性，并成功用于人血清中XA的检测，有望在电化学生物传感器领域广泛應用[51]。

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