4-甲基伞形酮对瘢痕疙瘩成纤维细胞的抗炎作用及机制研究

    牛星堂 林珣珣 朱昭炜 许澍洽 唐庆

    

    

    

    [摘要]目的：探讨4-甲基伞形酮（4-methylumbelliferone，4MU）对瘢痕疙瘩成纤维细胞的作用及机制研究。方法：体外培养的原代瘢痕疙瘩成纤维细胞（KFs）分别用浓度为0、0.2、0.4、0.8mM的4MU处理，采用CCK-8法和细胞划痕实验检测4MU对KFs细胞增殖和迁移能力的影响，通过ELISA、qPCR、免疫荧光染色和Western-bloting技术检测4MU对KFs炎症相关因子表达的影响。结果：4MU不仅抑制KFs细胞增殖迁移，而且可减少KFs对IL-6和IL-8的分泌，同时抑制HAS2和HAS3 mRNA的表达及α-SMA、TLR4、CD44、NF-κB1、P65蛋白的合成。结论：4MU可以抑制KFs增殖和迁移，并可通过抑制NF-κB通路相关基因的表达，减少KFs炎症因子分泌，因此，4MU有可能成为治疗瘢痕疙瘩的新药物。

    [关键词]4-甲基伞形酮;瘢痕疙瘩;炎症因子;TLR4;NF-κB1;作用机制

    [中图分类号]R619+.6? ? [文献标志码]A? ? [文章编号]1008-6455（2020）07-0097-04

    Abstract： Objective? To investigate the effect of 4-methylumbelliferone （4MU） on keloid fibroblasts （KFs）. Methods? Primary keloid fibroblasts were respectively treated with 4MU at concentrations of 0， 0.2， 0.4， and 0.8 mM. The proliferation and migration ability of KFs were detected by CCK-8 assay and cell migration assay. ELISA， qPCR， immunofluorescence and Western-bloting techniques were applied to study the effects of 4MU on the expression of inflammation-related genes in KFs. Results? 4MU not only inhibited the proliferation and migration of KFs， but also inhibited the secretion of IL-6 and IL-8. Additionally， 4MU inhibited the expression of HAS2 and HAS3， and reduced the synthesis of α-SMA， TLR4， CD44， NF-κB1 and P65 proteins in KFs. Conclusion? 4MU treatment can not only inhibit the activity of KFs， but also decrease the secretion of inflammatory by down-regulating the expression of NF-κB signal pathway. Therefore， 4MU has the potential to be a new drug for the cure of keloids.

    Key words： 4-methylumbelliferone; keloid; inflammatory factors; TLR4; NF-κB1; mechanism of action

    瘢痕疙瘩是一種临床常见的成纤维细胞过度增殖性疾病，常继发于各种皮肤损伤，多见于胸前区和耳垂，其病理特征主要表现为真皮增厚、细胞外基质（Extracellular matrix，ECM）增多及新生血管形成[1]。尽管目前存在多种治疗策略[2]，如手术切除、局部糖皮质激素类药物注射和放射治疗等[3-4]，但瘢痕疙瘩的治疗抵抗性和高复发率一直困扰着医生和患者。有研究认为瘢痕疙瘩成纤维细胞（Keloid fibroblasts，KFs）是瘢痕疙瘩形成的主要细胞，在瘢痕疙瘩发展过程中被持续的慢性炎症反应激活，继而引起相应病理改变[5]。此外，透明质酸（Hyaluronic acid，HA）作为ECM主要构成成分之一，在大多数损伤组织中，由透明质酸合成酶（Hyaluronan synthases，HAS）合成，随后被迅速清除，然而，在自身免疫性疾病病灶中HA可持续存在[6]。

    4-甲基伞形酮（4-methylumbelliferone，4MU）是一种香豆素衍生物，也被命名为7-羟基4-甲基香豆素。已有多项研究证实4MU对HA合成具有显著抑制作用[7-9]。近年来已有多项研究表明4MU在多发性硬化、1型糖尿病和类风湿性关节炎等人类疾病动物模型中可以预防纤维化和抑制自身免疫[10-13]。而且，目前已有4MU相关药物用于治疗胆道相关疾病。但是，4MU对KFs是否具有治疗作用仍然未知，因此，本研究拟通过不同浓度4MU处理KFs，探讨4MU在瘢痕疙瘩中对细胞增殖和炎症反应的影响，从而为瘢痕疙瘩的治疗提供新策略。

    1? 材料和方法

    1.1 主要材料：本实验已通过中山大学第一附属医院伦理委员会审批，伦理审批号为[2019]229。瘢痕疙瘩样本来源于中山大学附属第一医院整形外科手术切除的瘢痕疙瘩组织。标本来源患者平均年龄32岁，均已获得患者对标本使用的许可。

    主要试剂：4MU（纯度>99%）购买于MedChem Express公司，溶于DMSO中，储备浓度为1 000mM，储存于-20℃，使用浓度中DMSO浓度小于0.1%，对KFB的影响可以忽略不计。DMEM培养基、磷酸盐缓冲液（PBS）、胎牛血清（FBS）和1%青霉素-链霉素均采购自Gibco公司;CCK-8试剂盒购买自ApexBio公司;TRIzol?试剂和RIPA裂解缓冲液购买自Sigma公司;反转录试剂盒购买自Thermo公司;SYBR-GREEN-PCR试剂盒和ELISA试剂盒购买自Yesen公司;10%预制凝胶和聚偏二氟乙烯膜（PVDF）购买自ABSIN公司;实验所用抗体均购买自Proteintech公司;实验仪器和实验场地由中山大学附属肿瘤医院实验研究部提供。

    1.2 方法

    1.2.1 细胞培养及分组：手术中切除的瘢痕疙瘩标本置于50ml无菌离心管内并立即保存在冰盒中送往实验室。超净台内，使用无菌剪刀将瘢痕疙瘩组织表皮去除，真皮组织剪碎成约2mm大小，随后置于含有0.2% Ⅱ型胶原酶和10% FBS的DMEM培养基中，37℃恒温水浴锅震荡消化6h，待组织完全消化后，100μm无菌滤网过滤，过滤液1 000rpm离心5min，用5ml PBS重悬沉淀并再次离心，所得细胞接种于培养皿内常规培养（37℃，5% CO2）。实验中将4MU稀释至所需浓度（0mM、0.2mM、0.4mM、0.8mM）分别处理细胞。本研究所用细胞均为第3～6代细胞。

    1.2.2 细胞增殖检测：细胞消化离心后计数，每孔1.0×103个细胞种植于96孔培养板，含10% FBS培养基培养6h，细胞贴壁后，更换为含有不同浓度4MU的培养基继续培养。之后每隔一天使用CCK-8试剂盒检测细胞增殖情况。具体方法为：弃去原有培养基，每孔加入100μl培养基和10μl CCK-8溶液，在培养箱中避光放置3h，使用酶标仪（Bio-Tek EPOCH2，美国）在450nm波长处测定光密度值，每组有5个重复孔，所有检测均在3个不同细胞样本中重复进行。

    1.2.3 细胞划痕实验：KFs接种于6孔板中培养，当培养皿中细胞覆盖率达到90%时，PBS润洗细胞，用200μl移液管尖端用力刮除细胞，使用含有不同浓度4MU的无血清培养基继续培养。分别在0h及48h后拍照。

    1.2.4 qPCR检测：使用TRIzol?试剂从KFs中提取总RNA，根据说明书使用反转录试剂盒合成cDNA，采用SYBR-GREEN-PCR试剂盒在实时热循环仪（Bio-Rad-CFX96，美国）中进行定量PCR（qPCR）分析，以GAPDH为参考基因，2-△△ct值表示mRNA的相对表达情况，计算HAS2、HAS3、IL-6、IL-8的相对表达量。引物序列如下，IL-6引物：CCTGACCCAACCACAAATGC和CCTGACCCAACCACAAATGC;IL-8引物：TCCTGATTTCTGCAGCTCTGTGTG和AATTTCTGTGTTGGCGCAGTGTGG;HAS2引物：CTCTTTTGGACTGTATGGTGCC和AGGGTAGGTTAGCCTTTTCACA;HAS3引物：CAGCCTATGTGACGGGCTAC和CCTCCTGGTATGCGGCAAT;GAPDH引物：TGTGGGCATCAATGGATTTGG和ACACCATGTATTCCGGGTCAAT。每项均设三个重复孔，所有检测均在3个细胞样本中重复。

    1.2.5 Western blot检测：含有不同浓度4MU的10% FBS培养基培养KFs 48h后，用RIPA裂解液提取总蛋白，BCA试剂盒进行蛋白定量，和适量蛋白缓冲液混合并95℃加热变性。取等量蛋白加到10%预制凝胶（Precast PAGE Gel）中，电泳分离并电转至PVDF膜上。PVDF膜浸没在5%脱脂牛奶中，室温孵育120min。随后用特异性一抗和二抗孵育并使用化学发光液显影，检测TLR-4、CD44、NF-κB1和P65的蛋白表达情况。GAPDH作为内参蛋白，实验所用抗体除GAPDH和P65抗体是鼠源抗体外，其余均为兔源抗体。

    1.2.6 ELISA检测：含有不同浓度4MU的无血清培养基培养KFs 48h后，收取培養基，离心去除细胞碎片，根据ELISA试剂盒使用说明，检测细胞上清液中IL-6和IL-8含量[12]。实验数据来自酶标仪在450nm处测量的吸光度。实验在3种不同细胞样本中重复。

    1.2.7 免疫荧光实验：培养皿中种入0.5×103个KFs，待细胞贴壁后，分别使用含0mM和0.4mM 4MU的FBS培养基培养48h，4%多聚甲醛固定30min，随后分别用α-SMA一抗，NF-κB1和P65一抗孵育，放置4℃过夜，将细胞与不同荧光二抗在室温下孵育1h。用DAPI孵育染色细胞核核，并使用共聚焦显微镜系统拍摄照片。

    1.2.8 统计学分析：所有实验结果均采用软件GraphPad Prism 7进行分析。数据显示为均数±标准差。采用单因素方差分析比较各组间差异。当P<0.05时，表示差异有统计学意义。

    2? 结果

    2.1 4MU对KFs增殖的影响：经CCK-8法检测发现，4MU对KFs的增殖具有明显的抑制作用（P<0.05），并且呈剂量依赖性，4MU浓度越高，其抑制作用越强，见图1。

    2.2 4MU对KFs迁移能力的影响：如图2所示，划痕实验中KFs的迁移能力被4MU明显抑制，在0.4mM 4MU条件下，KFs几乎失去迁移能力。

    2.3 4MU对KFs中α-SMA表达的影响：免疫荧光结果表明，与对照组相比，4MU（0.4mM）处理组KFs中α-SMA荧光强度明显降低，见图3。

    2.4 4MU对透明质酸酶表达及炎症因子分泌的影响：qPCR结果表明，4MU可以降低KFs中HAS2和HAS3 mRNA表达水平（P<0.05），且浓度越高，对于HAS2的抑制作用越明显。4MU对于HAS3的抑制作用与4MU浓度未成明显的相关性（见图4A）。ELISA结果显示4MU明显抑制IL-6和IL-8的分泌（见图4B），且浓度越高抑制效果越强，与对照组相比差异有统计学意义（P<0.05）。同样，qPCR结果表明4MU在mRNA水平抑制IL-6和IL-8的表达（见图4C）。

    2.5 4MU对KFs中TLR-4、CD44、NF-κB1及P65产生的影响：采用不同浓度的4MU处理KFs 48h，然后收取KFs进行Western-blot和免疫荧光实验检测TLR4、CD44、NF-κB1及P65表达的变化。Western-blot分析结果表明，和未处理组相比，TLR4、CD44、NF-κB1及P65的蛋白表达量均有所降低（见图5A）。此外，免疫荧光染色图片显示，0.4mM 4MU处理组KFs中NF-κB1和P65的荧光强度比未处理组弱（见图5B），这与Western-blot结果相一致。

    3? 讨论

    瘢痕疙瘩是一种复杂的成纤维细胞增生性疾病，表现为真皮增厚，ECM合成增多，炎症因子分泌增加[5]。因此，抑制炎症反应和ECM积聚的方向成为研究者们关注的重点。HA作为ECM的一种构成成分，通过与其他ECM成分的相互作用，在创伤愈合、炎症反应和肿瘤发生发展中发挥着重要作用[14]。已有文献报道HAS2的下调可抑制瘢痕疙瘩角质形成细胞的增殖[15]。本研究结果提示，4MU可以下调HAS2和HAS3基因的表达，而且对KFs增殖和迁移能力有明显抑制作用。此外α-SMA作为细胞骨架蛋白，是成纤维细胞收缩表现的标志分子，α-SMA已被证实在瘢痕挛缩过程中起重要作用[16]，而本研究发现到4MU可以减少α-SMA的表达。因此4MU对瘢痕疙瘩形成过程具有潜在的抑制作用。

    瘢痕疙瘩网状层炎性细胞增多，促炎因子合成增加，促进了瘢痕疙瘩的形成[5，17]。尤其是IL-6的表达水平在瘢痕疙瘩中明显高于正常皮肤[18]。此外，NF-κB信号通路是调节免疫细胞分化、存活和增殖的炎症相关信号通路，持续的NF-κB信号可引起慢性炎症，诱导瘢痕疙瘩的形成[17]。本研究结果表明4MU不仅可以减少KFs中IL-6和IL-8的分泌，还可降低NF-κB1和P65基因表达水平。这些炎症相关基因表达的变化为4MU抗炎机制提供了可能的解释。

    CD44和TLR4作为成纤维细胞表面HA结合受体，与HA相互作用后可激活细胞内信号通路，参与创面愈合和细胞侵袭[19-20]。本研究观察到4MU处理组KFs中TLR4和CD44表达量降低，因此4MU可能通过抑制HAS2及HAS3转录，抑制HA合成，进而下调CD44、TLR4的表达，从而阻断HA经TLR4/CD44介导的NF-κB信号传导途径，最终起到抑制瘢痕疙瘩的作用。4MU对瘢痕疙瘩TLR4/CD44-NF-κB信号通路的影响部分阐明了4MU抑制瘢痕疙瘩炎症反应的机制。

    但由于目前实验条件限制，本次仅证明了4MU能抑制KFs中TLR4/CD44-NF-κB信号通路相关基因的表达。其具体调控机制有待后续实验探索完善。此外，由于目前缺乏适当的瘢痕疙瘩动物模型，实验研究仍停留在细胞水平，动物水平实验有待开展。

    综上所述，4MU对细胞增殖、迁移和炎症均有抑制作用，故4MU作为治疗瘢痕疙瘩的药物具有潜在的应用价值。

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    [收稿日期]2019-11-06

    本文引用格式：牛星堂，林珣珣，朱昭煒，等.4-甲基伞形酮对瘢痕疙瘩成纤维细胞的抗炎作用及机制研究[J].中国美容医学，2020，29（7）：97-100.