发酵枸杞原浆中多糖、活菌数的变化规律
马晓娟 谢有发 余银芳 李诒光
摘 要：本文旨在探究植物乳杆菌发酵枸杞原浆过程中多糖、活菌数的变化规律，考察枸杞多糖在乳酸菌发酵过程中的代谢情况及枸杞对乳酸菌生长的影响，以期为开发枸杞发酵饮品提供科学依据。枸杞原浆经植物乳杆菌发酵，采用苯酚-硫酸法测定其在发酵过程中的多糖含量，同时采用平板计数法测定发酵过程中植物乳杆菌的活菌数量。结果表明，枸杞多糖在发酵过程中的含量不断减少，但在发酵终点时仍可达到1271.78mg/L;植物乳杆菌的活菌数在4h之前增长缓慢，4～12h处于对数生长期，活菌数达6.84×109cfu/mL，12h后进入稳定期，28h后开始进入衰亡期，40h时活菌数仍达到2.57×109cfu/mL。
关键词：枸杞原浆? 枸杞多糖? 植物乳杆菌? 活菌数
枸杞是我国传统的药食同源性中药药材，性甘味平，滋补肝肾、益精明目[1]。枸杞原浆经乳酸菌发酵不仅会产生丰富愉悦的风味而让消费者更易接受，同时乳酸发酵带来的益生作用也提高了枸杞的药用保健价值，为枸杞类饮品市场扩展了更大的开发空间。
枸杞多糖（Lycium Barbarum Polysaccharides，LBP）是一種水溶性蛋白多糖，其作为枸杞的重要活性成分，主要有提高免疫力、抗肿瘤、抗衰老、降血糖、降血脂等生理作用[2-4]。中药材中的一些多糖类物质还具有一定的益生元功能——能够促进乳酸菌在肠道内的增殖[5-7]，最终达到调节肠道菌群、减少肠道疾病发生的效果。目前，关于酵母发酵枸杞酒或乳酸发酵枸杞果蔬饮品的工艺报道较多，如杨梅枸杞酒[8]、枸杞蓝莓酒[9]、石榴枸杞酒[10]等，陈万更用乳酸菌发酵了枸杞绿茶[11]，徐婧君等用植物乳杆菌发酵果蔬奶（枸杞与胡萝卜）[12]。但是，单纯以枸杞进行乳酸发酵的案例相对较少，且主要以工艺研究为主。许亮等[13]考察了枸杞果酒发酵过程中多糖先增大、后减小的变化规律，并最终维持在最低水平。本研究以发酵40h的枸杞原浆为检测样品，对不同发酵时间的原浆进行枸杞多糖和活菌数的测定，考察枸杞多糖和活菌数在发酵过程中的变化规律，以期为枸杞原浆的乳酸发酵机制提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
枸杞（市售宁夏中宁枸杞）;植物乳杆菌360（Lacto-bacillus plantarum），四川高福记生物科技有限公司;无水葡萄糖（食品级原料），山东保龄宝生物股份有限公司;D-无水葡萄糖（标准品），中国药品生物制品检定所;硫酸、苯酚、95%乙醇、NaCl、MRS固体培养基成分等试剂，均为分析纯。
1.2 仪器与设备
HM-928料理机，广州黑马电器有限公司;电子天平，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司;HH-4水浴锅，常州国华电器有限公司;TD5M台式低速离心机，长沙湘智离心机仪器有限公司;UV-1800紫外-可见分光光度计，SHIMADZU CORPORATION;立式压力蒸汽灭菌器，上海申安医疗器械厂;超净工作台，济南鑫贝西生物技术有限公司;恒温生化培养箱，上海博讯实业有限公司医疗设备厂;320 pH Meter，METTLER TOLEDO公司。
1.3 实验方法
1.3.1 发酵工艺
1.3.1.1工艺流程
干枸杞→料液比1：6→浸提→打浆（添加5%葡萄糖）→灭菌（105℃、15min）→冷却、接种（万分之八）→发酵（37℃、40h）→成品→去籽、调配饮料。
1.3.1.2 工艺要点
原料处理：挑取颗粒均匀、饱满的枸杞干果，用水冲洗两次以去除表面的杂质、灰尘等。
浸泡：以料水比1：6的比例，用温水（40～50 ℃）浸泡枸杞至变软。
打浆：将浸泡后的枸杞料液加入5%葡萄糖一起进行打浆、破碎。
灭菌：在105℃下灭菌15min，灭菌时间不能过长，否则会破坏枸杞的色泽。
冷却：采用自来水及时分段冷却。
接种：采用植物乳杆菌菌剂进行直投式接种，接种量为原浆重量的万分之八，将称好的菌剂溶于少量无菌水后投入原浆中。
发酵：在37℃下发酵40h，定期取样。
1.3.2 pH值测定
采用pH计进行测定，每隔4h取样。
1.3.3 多糖测定
采用苯酚-硫酸法[1，14]进行测定，每隔8h取样。
1.3.3.1 对照品制备
葡萄糖（0.1mg/mL）：准确称取无水葡萄糖标准品25mg，溶解后置于250mL容量瓶中定容。
1.3.3.2 标准曲线绘制
取标准溶液0.2 、0.4 、0.6 、0.8 、1.0mL至具塞试管，分别加水定容至2.0mL，然后加1mL5%苯酚溶液，摇匀后加入5mL浓硫酸（H2SO4）摇匀，静置10min。将具塞试管放入水浴锅（40℃）保温15min，迅速冷却至室温，放置20min后在490nm下进行紫外吸光度的测定。
1.3.3.3 供试样品制备
取50mL发酵前后的原浆离心，取上清液3mL，加入30mL95%乙醇，醇沉20min后离心，4000r/min离心20min;弃去上清液，用85%乙醇进行洗涤，最后加水定容至25mL;取200μL样品测定吸光度。
1.3.3.4? 样品多糖测定
取200 μL样品溶液至具塞试管，分别加水定容至2.0mL，加5%苯酚溶液1mL，摇匀后加入浓硫酸（H2SO4）5mL再次摇匀，静置10min;将具塞试管放入水浴锅（40℃）保温15min，迅速冷却至室温，放置20min;在490nm下进行紫外吸光度的测定。
1.3.4 活菌数测定
采用平板（MRS固体培养基）稀释法[15]，每隔4h取样。
1.3.4.1 样品处理
取发酵枸杞原浆1mL，加入至9mL无菌生理盐水中，稀释度为10-1样液，按此方法依次将枸杞原浆稀释到10-6、10-7样液备用。
1.3.4.2乳酸菌计数
取稀释度为10-6、10-7发酵枸杞原浆1000μL菌液涂布MRS固体培养基上，然后置于37℃恒温培养箱中培养48h，并记录单菌落数，同时计算出活菌数。
2 结果与讨论
2.1 发酵过程中的pH变化
枸杞原浆在发酵过程中的pH值动态变化如图1所示。在整个发酵过程中，发酵原浆的整体pH值呈下降趋势——起始pH值为4.92，在0～8h之间下降不明显，8～16h之间下降幅度最大，16h之后趋于平缓，发酵终点时pH值达到3.58。究其缘由，主要是因为枸杞原浆中的植物乳杆菌利用自身的酶类物质、通过EMP途径降解了枸杞原浆中的碳水化合物（如葡萄糖），进而发酵产生了大量有机酸（以乳酸为主），增加了发酵原浆的酸度，降低了pH值。到终点时pH值得变化趋于平缓，主要是由于乳酸菌进入衰亡期，产生的酸有所减少。
2.2 发酵过程中枸杞多糖的含量变化
以D-无水葡萄糖为对照品，以浓度C为纵坐标，吸光度A为横坐标绘制标准曲线，可得到回归方程：C=0.0698A-0.0017、R2=0.9991，式中A为吸光度，C为枸杞多糖浓度（mg/L）。枸杞多糖在发酵过程中的动态变化如图2所示，整个发酵过程中枸杞多糖呈下降趋势——发酵前多糖含量为2272.25mg/L，发酵终点时达到1271.78mg/L，减少了44.03%。在0～8h之间减速放缓，8～16h之间下降最快，16～40h下降缓慢至趋于平缓，这种趋势同pH值的下降趋势基本一致。发酵过程中出现的枸杞多糖变化可能是由于枸杞多糖作为益生元被植物乳杆菌吸收、利用，从而起到了增菌作用[16-17];也可能因为枸杞多糖是一种含少量蛋白质的多糖复合物[18-19]，植物乳杆菌利用枸杞多糖作为碳源或植物乳杆菌产生的酶将其降解[20]，生成了小分子物质，致使多糖含量降低。而在发酵前期，植物乳杆菌优先利用单糖葡萄糖，后期转为利用多糖。
2.3 发酵过程中乳酸菌的活菌数变化
植物乳杆菌的活菌数在发酵过程中的动态变化如图3所示，活菌数随发酵时间的增加先升高后降低，生长趋势与束文秀等[21]研究中乳酸菌的生长趋势一致。在0～16h植物乳杆菌的生长速度较快，呈现上升趋势;4h之前缓慢增长，在12h时接近达到了最高点，活菌数为6.84×109cfu/mL;12～28h时生长平缓，处于稳定期;28h之后下降明显。究其缘由，主要是由于发酵原浆中碳源等营养物质的减少和代谢产物尤其是酸的产生影响了乳酸菌的生长。整个发酵过程中，活菌数均处于108cfu/mL以上，说明枸杞对植物乳杆菌的生长有促进作用。
3 结论与讨论
本研究考察了枸杞原浆在发酵过程中pH值、枸杞多糖和活菌数的变化规律。结果表明，发酵过程中，pH值和枸杞多糖呈现下降趋势，活菌数先上升后下降，最终pH值达到3.58、枸杞多糖含量达1271.78mg/L、植物乳杆菌活菌数达2.57×109cfu/mL。如果將发酵好的枸杞原浆稀释100 倍调配成枸杞饮料，其活菌数仍可达到≥106cfu/mL的乳酸菌活菌饮品标准[22]。
本研究中，枸杞多糖减少的结果不同于许亮[13]研究的枸杞果酒中枸杞多糖先增加后减少的结果，这种差别可能由于菌种和发酵条件不同所引起。枸杞多糖的减少反映出植物乳杆菌的代谢对枸杞有一定的作用或影响，其可能被消耗或降解为其他更容易被人体吸收的物质。李越鲲[23]研究的枸杞多糖经超声波降解LBP-s水溶性增强，体外抗氧化活性高于粗多糖，说明多糖降解后也可以发挥出更好的作用。此外，枸杞多糖也可作为益生元对乳酸菌起到增殖作用。从益生菌对人体有益健康的角度开发产品，在益生菌类产品中添加枸杞多糖等中药提取物，通过增强益生菌与多糖的协同作用更利于产品的销售和消费者的青睐。但是发酵过程中枸杞多糖的变化机制和具体原因尚未得出明确结论，需在进一步的研究中进行探讨。
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