龙血素B对角质形成细胞增殖和迁移的影响

    张文瑞　许春姣　郭怡婷　孙煜梅

    

    

    

    [摘要]目的：观察龙血素B（Loureirin B，LB）对体外培养人永生化角质形成细胞（Immortalized human keratinocytes，HaCaT）增殖和迁移的影响，探究LB是否促进创面愈合再上皮化过程。方法：噻唑蓝（MTT）法检测不同浓度LB对体外培养HaCaT细胞增殖的影响，细胞划痕实验分析LB对HaCaT细胞迁移的影响。结果：5、10、25、50μg/ml LB呈剂量依赖性抑制HaCaT细胞增殖（P<0.05），10、25μg/ml LB呈剂量依赖性抑制划痕愈合及HaCaT细胞迁移（P<0.01）。结论：LB具有显著抑制HaCaT细胞增殖和迁移的作用，提示LB可能抑制创面愈合再上皮化过程。

    [关键词]龙血素B;角质形成细胞;细胞增殖;创面愈合;再上皮化

    [中图分类号]Q343.6? ? [文献标志码]A? ? [文章编号]1008-6455（2020）08-0031-03

    The Effects of Loureirin B on Proliferation and Migration of HaCaT Cells

    ZHANG Wen-rui，XU Chun-jiao，GUO Yi-ting，SUN Yu-mei

    （Central of Stomatology，Xiangya Hospital，Central South University，Changsha 410008，Hunan，China）

    Abstract： Objective? To observe the effects of Loureirin B （LB） on proliferation and migration of human immortalized human keratinocytes （HaCaT） in vitro， and explore whether LB can promote the re-epithelialization process of wound healing. Methods? The effects of different concentrations of LB on proliferation of HaCaT cells were evaluated by MTT assay， and the effects on migration of HaCaT cells were analyzed by scratch wound assays. Results? 5， 10， 25， 50μg/ml LB inhibited proliferation of HaCaT cells in a dose-dependent manner （P<0.05）. 10， 25μg/ml LB suppressed scratch closure and migration of HaCaT cells in a dose-dependent manner （P<0.01）. Conclusion? LB can significantly inhibit proliferation and migration of HaCaT cells， suggesting that LB may have an inhibitory effect on the re-epithelialization process of wound healing.

    Key words： Loureirin B; keratinocytes; cell proliferation; wound healing; re-epithelialization

    龙血竭（Dragons blood，DB）为龙血树属植物树干受损伤后，在微生物侵染和或自然氧化作用下产生的含脂木材经乙醇提取得到的树脂，是血竭的国产替代品[1-2]。龙血竭具有活血化瘀、止血、降糖降脂、抗菌、增强免疫、促进表皮修复、抗炎、镇痛、抗肿瘤等药理作用，临床上用于治疗冠心病、消化性溃疡、软组织损伤、放射性皮炎、烧伤、壓疮等[3]。创面愈合基本过程有三期[4]：①炎症期;②增生期：包括再上皮化、血管再生、纤维组织增生和伤口收缩;③改建期。大量研究表明龙血竭促进创面愈合[5-7]，但研究中多使用其简单提取物或成方制剂，涉及其内在有效成分的研究不多，具体促进创面愈合的活性成分尚未明确。龙血素B（Loureirin B，LB）是龙血竭中含量较为丰富的二氢查耳酮类化合物，具有抗氧化[8]、活血[9]、抗炎[10]、镇痛[11]等作用，本研究通过观察LB对体外培养的HaCaT细胞增殖及迁移的影响，探究LB是否促进创面愈合再上皮化过程。

    1? 材料和方法

    1.1 细胞：人永生化角质形成细胞（HaCaT），由中南大学湘雅医院皮肤科实验室馈赠。

    1.2 药品与试剂：龙血素B（中国食品药品检定研究院，批号：111558-201407）;胎牛血清（BI，以色列）;高糖DMEM培养基、青-链霉素、PBS（HyClone，美国）;胰酶-EDTA消化液（Gibco，美国）;MTT、二甲基亚砜（DMSO）（Sigma，美国）。

    1.3 仪器：超净工作台（上海力申科学仪器公司，中国，型号：HFsafe-1200TE）;二氧化碳培养箱（Thermo Fisher，美国，型号：371）;倒置显微镜（Leica，德国，型号：DMIL-LED）;全波长酶标仪（BioTek，美国，型号：Epoch）;离心机（Eppendorf，德国，型号：5702 R）;微孔板振荡器（Thermo Fisher，美国，型号：4625-1CEM）;电子天平（METTLER TOLEDO，中国，型号：EL204）。

    1.4 方法

    1.4.1 HaCaT细胞培养：将冻存状态的HaCaT细胞于37℃下快速复苏后，接种于培养瓶中，加入含10%胎牛血清及1%青-链霉素的DMEM培养液，置于37℃、5% CO2培养箱中培养，待细胞接近长满单层后胰酶消化并传代。

    1.4.2 LB母液制备：将20mg LB溶解于800μl DMSO，制备成浓度为25mg/ml的母液，分装，-80℃保存备用。

    1.4.3 MTT细胞增殖抑制实验：取对数生长期的HaCaT细胞，经消化、重悬、计数后，调整细胞密度为5×104/ml，每孔100μl细胞悬液接种于96孔板，空白调零组加不含细胞的培养液100μl，边缘孔100μl PBS填充。置于培养箱中培养24h贴壁后取出，弃去培养液，分别加含不同浓度LB（2.5、5、10、25、50μg/ml）10%胎牛血清DMEM培养液，平行5孔，阴性对照组加入含0.2% DMSO的培养液。继续培养48h后弃上清液，PBS洗1次，每孔加入MTT（5mg/ml）与含10%胎牛血清DMEM按1：10体积配置的培养液100μl，37℃下继续孵育4h，1ml注射器小心吸弃孔内培养液，加入100μl DMSO，室温振荡10min以使结晶物充分溶解，酶标仪上在570nm波长处测定各孔光密度值（OD值）。重复实验3次。

    相对细胞活力计算公式：

    1.4.4 观察细胞形态：取对数生长期的HaCaT细胞，用含10%胎牛血清的DMEM培养液调整细胞浓度，以2.5×105个/孔接种于6孔板中。37℃孵育24h后，更换培养液为含0.1% DMSO或25μg/ml LB的10%胎牛血清DMEM培养液，置于37℃、5% CO2培养箱中继续培养24h，倒置显微镜100×、200×、400×放大倍数下观察细胞形态并拍照。

    1.4.5 细胞划痕实验：取对数生长期HaCaT细胞，用含10%胎牛血清的DMEM培养液调整细胞浓度，以5×105个/孔接种于6孔板中，提前用记号笔在6孔板背后约每隔1cm划1条直线，横穿过孔，每孔划3条线，37℃、5% CO2的培养箱中培养，待细胞长满单层后，取出6孔板，用10μl枪头垂直标记线笔直划下，贴壁缓慢加入PBS洗3次，去除漂浮细胞，实验组加入含10μg/ml、25μg/ml LB的1%胎牛血清DMEM培养液，对照组加入含0.1% DMSO的1%胎牛血清DMEM培养液，置于37℃、5% CO2培养箱中继续培养。分别于0h、24h倒置显微镜下观察细胞的愈合程度，以每条标记线的上下缘与划痕交叉点作为观察点，即每孔6个观察点，拍照记录。重复实验3次。使用ImageJ软件测量划痕面积。

    划痕愈合率计算公式：

    1.5 统计学分析：使用SPSS 22.0软件进行处理，数据用（x?±s）表示，两组间比较采用t检验。P<0.05为差异有统计学意义，P<0.01为差异有显著统计学意义。

    2? 结果

    2.1 LB对HaCaT细胞增殖活力的影响：如图1所示，与0.2% DMSO对照组相比，LB作用HaCaT细胞48h，在浓度为5μg/ml（P<0.05），10、25、50μg/ml（P<0.01）时细胞增殖活力被显著抑制，并呈剂量依赖性。本次预实验中采用浓度低于2.5μg/ml梯度浓度LB处理HaCaT细胞亦未见促增殖作用。

    注：与0.2% DMSO对照组相比，*P<0.05，**P<0.01

    2.2 LB对HaCaT细胞形态的影响：如图2显示，0.2% DMSO对照组细胞密度大，贴壁能力强，仅少量细胞变圆，25μg/ml LB组细胞密度相对减小，较多细胞体积缩小变圆，与周围的细胞连接消失，贴壁性变差，折光性增强。

    2.3 LB对HaCaT细胞迁移的影响：如图3显示，与0.1% DMSO对照组相比，10μg/ml、25μg/ml LB作用HaCaT细胞24h，划痕愈合被显著抑制（P<0.01），并呈剂量依赖性。

    注：与0.1% DMSO对照组相比，**P<0.01

    3? 讨论

    血竭又名“麒麟竭”，来源于棕榈科植物麒麟竭（Daemonorops draco BI.），由该植物果实渗出的树脂经加工制成，多产于印度尼西亚，也称为进口血竭。血竭成分復杂，血竭素（Dracorhodin）是其主要有效成分。而国产血竭为百合科龙血树属剑叶龙血树（Dracaena cochinchinensis）的含脂木材经乙醇提取得到的树脂，包括产于广西、云南、海南的龙血竭，其主要活性成分为龙血素A、龙血素B等。血竭、龙血竭来源不同，主要活性成分不同，龙血竭尚不能完全代替血竭[12-13]。此外Dragons blood还可来源于巴豆属（Croton spp.）植物及紫檀属（Pterocarpus spp.）植物[14]。

    研究表明血竭、龙血竭均可促进创面愈合。而本研究发现LB具有显著抑制HaCaT细胞增殖和迁移的作用，提示LB可能抑制创面愈合的再上皮化过程，与预期结果相反。李丹等[15]发现血竭乙酸乙酯提取物具有显著促进HaCaT细胞增殖作用，提示血竭可能具有促进创面愈合中再上皮化的作用。血竭素高氯酸盐可促进成纤维细胞增殖及伤口愈合[16]，而国产龙血竭不含进口血竭所含有的血竭素[17]。于浩飞等[6]发现龙血竭软膏促进大鼠创伤愈合，且龙血素A、B含量较高的软膏效果更明显，猜测龙血竭多酚性成分可能与龙血竭愈创活性有关。多酚类化合物可能在伤口表面上形成保护层，其物理屏障及抗菌抗炎作用可防止感染，也可能通过与蛋白质结合而凝结并堵塞伤口，间接促进创面愈合[14，18]。龙血竭中化学成分复杂，酚类化合物是其主要生物活性成分，根据结构主要分为：①二氢查耳酮类，有龙血素A，B，C，D和剑叶龙血素A等;②查耳酮类;③黄烷类;④黄酮类和二氢黄酮类;⑤色原酮类;⑥聚合黄酮类;⑦其他酚类，如白藜芦醇、紫檀茋。此外还有多种萜类、甾体及甾体皂苷类成分[19]。龙血竭促进创面愈合的成分及其机制仍有待进一步研究。

    研究表明LB通过TGF-β通路抑制瘢痕成纤维细胞增殖和细胞外基质沉积[20-21]，LB通过Wnt/β-catenin通路抑制肝星状细胞增殖[22]，LB抑制脂肪细胞增殖并使细胞增殖周期阻滞在G2期[23]，提示LB可能对多种细胞有抑制增殖作用。其机制可能与LB通过激活Akt/GSK3β通路来增加微管稳定性[24]，抑制有丝分裂过程有关。观察到LB作用HaCaT细胞后出现细胞变圓、细胞连接消失等凋亡早期形态改变，LB是否促进HaCaT细胞凋亡仍需进一步研究。

    LB抑制血浆纤溶酶原激活物抑制剂-1（plasminogen activator inhibitor-1，PAI-1）活性[9]，是其活血化瘀的重要机制。而PAI-1在上皮细胞迁移和伤口愈合中发挥重要作用[25-27]，抑制PAI-1活性会抑制上皮细胞迁移和伤口愈合[28]。因此，LB可能通过抑制PAI-1活性抑制HaCaT细胞迁移并影响伤口愈合再上皮化过程，但LB是否抑制创面愈合仍需进一步体内实验研究。

    综上所述，LB具有显著抑制HaCaT细胞增殖和迁移的作用，提示LB可能抑制创面愈合再上皮化过程，龙血竭促进创面愈合的成分及其机制仍有待进一步研究。此外，对龙血竭有效成分的分离与研究仍需进一步深入，探明各成分及其作用机制，细化中药成分及用途，其应用前景将更广阔。

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    [收稿日期]2019-12-30

    本文引用格式：张文瑞，许春姣，郭怡婷，等.龙血素B对角质形成细胞增殖和迁移的影响[J].中国美容医学，2020，29（8）：31-34.