基于多反应监测模式下的超高效液相色谱-串联质谱法检测动物源性食品中19种氟喹诺酮类抗生素残留
摘 要：本文的目的是建立动物源性食品中19种氟喹诺酮类抗生素残留量的检测方法，样品经EDTA-Mcllvaine缓冲液提取、PEP固相萃取柱净化，通过Thermo Fisher Hypersil Gold C18（内径100×2.1mm，粒径1.7μm）进行分离，再用0.2%甲酸水溶液和甲醇乙腈溶液（体积比为40∶60）洗脱体系分离目标化合物，将目标化合物的保留时间、前体离子、子离子碎片及其相对丰度作为定性依据，选择响应稳定性好、信号强的子离子碎片作为定量离子，基质外标法定量。结果表明，19种氟喹诺酮类药物在2～100ng/mL范围内线性关系良好，相关系数均大于0.995；加标回收率在60%～120%，相对标准偏差均<20%。因此判定，该方法操作简单、灵敏度高、重现性好，符合动物源性食品中多种氟喹诺酮类残留量的检测要求。
关键词：多反应监测 氟喹诺酮 动物源性食品 超高效液相色谱-串联质谱联用
氟喹诺酮类抗生素药物的发展历史可以追溯到50多年前[1]。氟喹诺酮类药物（Fluoroquinolones，FQs）是人工合成抗菌药[2-4]，又称吡啶酸类、沙星类药物，是喹诺酮药物的第三代发展产物，主要包括恩诺沙星（Enrofloxacin）、诺氟沙星（Norfloxacin）、培氟沙星（Pefloxacin）、环丙沙星（Ciprofloxacin）、氧氟沙星（Ofloxacin）、沙拉沙星（Sarafloxacin）、依诺沙星（Enoxacin）、洛美沙星（Lomefloxacin）、吡哌酸（Pipemidic acid）、萘啶酸（Nalidixic acid）、奥索利酸（Oxolinic acid）、氟甲喹（Flumequine）、西诺沙星（Cinoxacin）、单诺沙星（Danofloxacin，又名丹诺沙星、达氟沙星）、马波沙星（Marbofloxacin）、氟罗沙星（Fleroxacin）、奥比沙星（Orbifloxacin）、司帕沙星（Sparfloxacin）、双氟沙星（Difloxacin）等。氟喹诺酮类药物具有抗菌、抗支原体、抗球虫等作用，可有效预防和治疗动物泌尿生殖系统疾病、胃肠疾病，以及呼吸道、皮肤组织的感染性疾病，价格低、疗效好[2]。但是，此类藥物在被广泛用于畜牧业养殖、加工贮存的过程中必然会造成动物源性食品中（如肉制品、牛奶、鸡蛋等）该类抗生素药物的残留[5-10]，人们长期食用此类食品可能导致身体出现细菌耐药性、过敏、中毒、致癌、致畸、致突变等严重伤害[11-14]。
近年来，由于部分养殖户和经营者为了躲避食品抽查而不断变换或更新氟喹诺酮类抗生素的使用品种，致使动物源性食品中该类抗生素残留超标问题时有发生，针对这一现象，扩大此类抗生素检测范围的探索应与时俱进。本文旨在建立超高效液相色谱-质谱联用法以同时检验出动物源性食品中19种氟喹诺酮类抗生素的残留量，优化检验方法、提高检验效率、扩大检验范围，以期为在动物源性食品中开展多种抗生素残留的检测提供参考。
1 试验部分
1.1 仪器与试剂
仪器：Thermo TSQ QUANTUM ULTRA超高效液相色谱-三重四极杆质谱联用仪（美国Thermo Fisher科技公司）、台式高效冷冻离心机（盐城市安信实验设备有限公司）、多管涡旋混合均质器（美国Thermo Fisher科技公司）、真空过柱装置（天津市津腾实验设备有限公司）、氮吹仪（天津恒奥科技发展有限公司）、百分之一电子天平（奥豪斯）、PEP固相萃取柱（200mg、6mL，博纳艾杰尔）。
试剂：Quinolone Mix19（100μg/mL）：Enrofloxacin、Norfloxacin、Pefloxacin、Ciprofloxacin、Ofloxacin、Sarafloxacin、Enoxacin、Lomefloxacin、Pipemidic acid、Nalidixic acid、Oxolinic acid、Flumequine、Cinoxacin、Danofloxacin、Marbofloxacin、Fleroxacin、Orbifloxacin、Sparfloxacin、Difloxacin，均购自BEIJING MANHAGE BIOTECH（编号C0006319）；供试试剂有乙腈、甲醇、甲酸，均为HPLC级；氢氧化钠、柠檬酸、乙二胺四乙酸二钠、磷酸氢二钠均为优级纯；实验用水为屈臣氏蒸馏水。
样品：市售猪肉20份、羊肉20份、鸡肉10份、鸡蛋10份、牛奶10份。
1.2 试验方法
1.2.1 提取
称取试样5.00g（精确到0.01g）置于50mL聚丙烯离心管中，加入15mL 0.1mol/L EDTA-Mcllvaine缓冲液，2500r/min涡旋混合1min，低温（温度低于20℃）超声提取10min，10000r/min离心10min（温度低于5℃），取上清液。提取3次，合并上清液，EDTA-Mcllvaine缓冲液定容至50mL。
1.2.2 净化
PEP固相萃取柱，使用前用6mL甲醇、6mL水进行活化。将10mL提取溶液以2～3mL/min的速度过柱，用2mL 5%甲醇淋洗，弃去淋洗液；小柱真空负压抽干（时间大于 20min），再用6mL甲醇洗脱并收集洗脱液；洗脱液于40℃下使用氮气吹至近干，用1mL 0.2%甲酸水溶液溶解，旋涡混合1min，过0.22μm滤膜，上机待测。
1.3 基质标曲制备
1.3.1 混合标准储备液（10μg/mL）
精密吸取19种混合标准物质各1.00mL置于10mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀备用。
1.3.2 混合标准中间溶液（1μg/mL）
精密吸取混合标准储备液1mL置于10mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀备用。
1.3.3 混合标准工作溶液（100ng/mL）
精密吸取混合标准中间溶液1mL，置于10mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀备用。
1.3.4 基质标准工作曲线
分别使用不含氟喹诺酮类药物的猪肉、羊肉、鸡肉、鸡蛋、牛奶作为空白基质。准确称取阴性试样5.00g（精确至0.01g）置于50mL聚丙烯塑料离心管中，分别加入不同体积的19种氟喹诺酮类混合标准工作溶液，然后加入EDTA-Mcllvaine缓冲溶液，在涡旋混合器上混合均匀，同样品前处理及净化步骤，待吹至近干后，用初始比例流动相溶液定容配制成浓度分别为2、5、10、20、100ng/mL的标准系列。
1.4 仪器条件
1.4.1 色谱条件
色谱柱：Thermo Fisher Hypersil Gold C18（内径100×2.1mm、粒径1.7um）；柱温：40℃；进样体积5μL；流速0.2mL/min；流动相A：0.2%甲酸水溶液，流动相B：甲醇-乙腈溶液（体积比为40∶60）。梯度洗脱条件见表1。
1.4.2 质谱条件
ESI正离子模式，喷雾电压3.5kV，蒸发温度350℃，离子传输管温度350℃，鞘气（N2）流量30arb，辅助气（N2）10arb。
2 结果分析
2.1 方法优化
2.1.1 样品制备
分别采用EDTA-Mcllvaine缓冲溶液和1%甲酸乙腈来提取猪肉、羊肉、牛奶中的19种氟喹诺酮类化合物，发现其虽然沉淀蛋白效果较好，但会因提取到更多的磷脂而严重干扰出峰时间较晚的Cinoxacin、Oxolinic acid、Nalidixic acid和Flumequine，且加标回收率偏低。
采用EDTA-Mcllvaine缓冲溶液提取的样品提取液在过PEP固相萃取柱时均出现了不同程度的堵塞情况，故实验对比了过滤样品提取液、分取样品提取液和钨酸钠-硫酸沉淀样品提取液3种方法解决净化柱堵塞问题。结果表明，分取样品提取液过PEP固相萃取柱实验效率高，处理的样品干净，回收率高。
2.1.2 色谱质谱条件
考察了有机相为100%乙腈、100%甲醇、40%甲醇+60%乙腈的出峰分离情况。结果显示，40%甲醇+60%乙腈在不同基质下分离度最好，目标化合物的保留时间在各种类型的基质中相对稳定，同时可将羊肉中的环丙沙星干扰物彻底分离。
考察了水相为纯水、0.2%甲酸水和5mmol甲酸铵水溶液的出峰分离情况，在水相中添加甲酸可提高仪器对目标化合物的响应且能够改善峰形，而甲酸铵会导致背景升高，影响方法灵敏度，故选择0.2%甲酸水。
将配制好的19种氟喹诺酮类化合物的混合标准中间溶液（1μg/mL）通过蠕动泵以5μL/min的流速注入质谱仪，调整离子源参数，待喷雾稳定后进行Q1四极杆全扫描，找到目标化合物的前体离子，设定碰撞能5～50eV区间分9次进行碰撞，通过Q3四极杆找到仪器响应和稳定性俱佳的定性离子和定量离子，同时进一步优化锥孔电压，从而建立多反应监测模式分析方法。19种化合物质谱参数优化结果见表2。
2.2 方法参数验证
2.2.1 线性实验
以牛奶为例，用空白基质提取液将混合标准工作溶液分别稀释浓度至2、5、10、20、100ng/mL，以氟喹诺酮质量浓度作为横坐标（X），定量离子的峰面积作为纵坐标（Y），进行线性拟合，得到基质匹配的标准曲线及相关系数，见表3。
2.2.2 方法的灵敏度
以取样量5.00g，在上述样品处理与色谱质谱条件下，根据3倍信噪比和10倍信噪比所对应的各氟喹诺酮药物质量浓度为仪器的检出限和定量限。方法中19种氟喹诺酮的检出限为0.03～0.5μg/kg，定量限为0.1～2μg/kg。
2.2.3 方法的精密度和回收试验
在牛奶、豬肉、鸡蛋阴性样品中分别添加0.1、20和100μg/kg这3个水平进行添加回收实验。按照上述方法进行测定，每个添加浓度测定6次，在较低浓度下，样品添加回收率在60%～120%，相对标准偏差<20%，方法精密度良好。
2.3 样品测定
采用上述检测方法，对市售猪肉、羊肉、牛奶等70份样品中19种氟喹诺酮类药物残留进行检测，检出氧氟沙星阳性样品1份，样品为羊肉，含量为15.8μg/kg。
3 结论与讨论
本实验运用超高效液相色谱-串联三重四极质谱联用仪建立的多反应监测模式下同时测定动物源性食品中19种氟喹诺酮类药物残留量，其灵敏度与回收率高，重现性好，抗干扰能力强，符合我国对喹诺酮类药物残留的监管要求，能够为食品安全风险监测工作提供准确有效的理论依据。
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