细胞焦亡相关炎症因子在狼疮性肾炎发病机制中的研究进展

    覃卿 林栩

    【摘要】?细胞焦亡（pyroptosis）是一种依赖半胱氨酸蛋白酶，由成孔蛋白GSDMD介导的细胞程序性死亡模式，可释放大量炎症因子介导免疫炎症，具有免疫原性和炎症性。狼疮性肾炎（lupus nephritis，LN）是在系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus，SLE）发展中的一种肾小球肾炎，免疫失调和炎症反应贯穿其中。细胞焦亡过程中释放的相关炎症因子在LN的发病机制中起重要作用，可导致LN的发生和发展，是目前研究的热点，有望为LN诊断和治疗提供新方略。

    【关键词】?细胞焦亡;炎症因子;狼疮性肾炎;机制

    中图分类号：R692?文献标志码：A?DOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2020.12.001

    【Abstract】?Pyroptosis is a kind of programmed cell death mode which is dependent on cysteine protease and mediated by pore forming protein GSDMD. It can release a large number of inflammatory factors and mediate immune inflammation， which has immunogenicity and inflammation. Lupus nephritis （LN） is a kind of glomerulonephritis in the development of systemic lupus erythematosus （SLE）， and immune disorders and inflammatory reactions run through this process. Inflammatory factors released in the process of pyroptosis play an important role in the pathogenesis of LN， which can lead to the occurrence and development of LN. It is a research hotspot at present and is expected to provide a new strategy for the diagnosis and treatment of LN.

    【Key words】?pyroptosis; inflammatory factor; LN; pathogenesis

    系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus，SLE）是一种致命性自身免疫性和炎症性疾病，其特征在于产生自身抗体和炎性细胞介导的多器官损伤。狼疮性肾炎（lupus nephritis，LN）是SLE的严重表现，其特征是包含与核酸和识别这些分子的自身抗体结合的核酸和/或蛋白质的免疫复合物沉积于肾脏[1]，导致肾脏损伤。在SLE和LN中[2]，失调性的细胞死亡和死亡细胞的清除缺陷被认为有助于自身抗原的产生和自身抗体及其他异常免疫反应的诱导。所以在LN的发病机制中，各种细胞死亡过程中的失调（例如凋亡、原发性和继发性坏死、焦亡等）和免疫系统对这些过程的反应可能发挥着重要的作用。在细胞死亡的各种类型中，细胞焦亡（pyroptosis）涉及核变化，可导致完整核释放，成为潜在抗核抗体的自身抗原来源，这对于SLE和LN的发生发展有不可忽视的影响[1]。已经证实在SLE细胞焦亡过程中相关的炎症因子可能有助狼疮累及肾脏细胞[3]，可以认为细胞焦亡及其过程中相关炎症因子在LN的发病中起重要作用。现就焦亡相关炎症因子在LN发病机制中的作用进行综述。

    1?细胞焦亡促进炎症因子释放介导免疫炎症

    焦亡是一种被定义为gasdermin D（GSDMD）介导的细胞炎性坏死，它是对危险信号的反应，由炎症小体激活触发，致使白细胞介素-1β（IL-1β）和白细胞介素-18（IL-18）及炎性细胞物质（HMGB1和ATP等）释放[4]，从而促进炎症反应，快速启动免疫反应。焦亡过程包括细胞膜孔形成、渗透膨胀和早期膜破裂，炎性细胞内容物外流，可激活机体炎症反应，因此是炎症性的。由于依赖的炎性半胱氨酸蛋白酶不同，焦亡可分为经典途径和非经典途径，虽然最终都会导致细胞裂解和促炎细胞因子的释放，但它们的机制有显著差异。在经典途径中，胞质溶胶中的钾外流、活性氧的产生和离子通量的泄漏等机制[5]激活NOD样受体蛋白3（NOD-like erceptor protein 3，NLRP3）炎症小体，进而诱导一系列依赖半胱氨酸蛋白酶-1（Caspase-1），切割GSDMD的炎症反应。与经典途径不同，非经典途径激活由小鼠的半胱氨酸蛋白酶-11（Caspase-11）和人类的半胱氨酸蛋白酶-4/5（Caspase-4/5）触发，不依赖炎症小体激活。非经典途径的细胞焦亡识别细胞内的脂多糖，直接裂解GSDMD成孔蛋白形成环状低聚物，与质膜内小叶结合成孔，诱导细胞裂解。

    2?细胞焦亡相关炎症因子促进LN发生发展

    2.1?NLRP3炎症小体

    炎症小体是髓系抗原呈递细胞胞质内的危险信号平台，它将各种病原体相关或损伤相关信号整合到Caspase-1的激活中。包含NACHT、LRR和NLRP3炎症小体由模式识别受体（PRRs）、NLRP3、包含CARD结构域的凋亡相关斑点样蛋白（ASC）和半胱氨酸蛋白酶前体组成。炎症小体在静止状态下被认为是抑制的，多种内源性或外源性信号可解除这种抑制[6]。被激活时，NLRP3炎症小体需要一个初始的信号，激活核因子-κB，诱导NLRP3和IL-1β前体的转录，并导致NLRP3蛋白的翻译后修饰，这是激活所必需的。第二个NLRP3特异性激活信号触发构象变化，导致NLRP3寡聚化[7]。目前发现NLRP3炎症小体激活有四个主要途径。首先，在钾离子外流模型中，代谢物和内毒素破坏细胞膜的完整性，ATP是响应细胞和组织损伤而释放到细胞外空间的嘌呤能介质，高浓度的ATP 可激活嘌呤受体P2X7，促进钙离子和钠离子的流入，并与双孔域弱内向整流钾离子通道2 （TWIK2）协调，细胞内钾的流出，以及线粒体结构和功能的破坏，最终激活NLRP3炎症小体[8～9]。二是活性氧的直接活化，线粒体来源的活性氧直接激活NLRP3炎症小体，使用特定的活性氧抑制剂，发现下游表达的IL-1β生成明显减少[10]。第三，进入细胞的物质，如晶体或颗粒，会导致组织蛋白酶的释放，从而激活炎症小体[11]。第四，代谢物如脂肪酸、肽和毒素也可以通过包裹微孔结构来激活NLRP3炎症小体[11]。由此可见NLRP3炎症小体的激活机制复杂，受多种因素调控。由于多种肾脏疾病（如IgA肾病、狼疮性肾炎、急性肾小管损伤和高血压或血管性肾硬化等）比健康肾脏表达更高水平的NLRP3基因，这表明NLRP3在多種肾脏疾病中起作用。随着LN的发展，NLRP3基因在MRL/lpr小鼠中的表达显著增加[12]。研究发现[13]，NLRP3炎症小体可在LN足细胞中被激活产生蛋白尿，损害肾功能，在健康供体中则没有。该发现证明NLRP3炎症小体可在足细胞被激活并参与LN的发病。在抗dsDNA抗体的存在下，自身dsDNA可以通过活性氧激活NLRP3炎症小体，从而诱导人单核细胞产生IL-1β，且NLRP3炎症小体还可以通过糖原合酶激酶3-β（GSK3-β）的激活诱导LN[14～15]。因此，通过调控NLRP3的表达可预防或减轻LN的功能障碍、损伤和炎症，NLRP3有望成为治疗LN的新靶点。

    2.2?GSDMD

    GSDMD是一种含有53 kDa gasdermin结构域的蛋白质，是导致炎性形式的裂解性细胞死亡的因子[16]，介导重要的抗菌先天免疫防御机制。GSDMD在免疫细胞和小肠黏膜上皮细胞表面广泛表达，处于半胱氨酸蛋白酶表达的下游。活化的半胱氨酸蛋白酶切割GSDMD，将其N-末端成孔结构域和C-末端阻遏结构域之间的接头分开，以破坏两个结构域之间的自身相互抑制作用，释放的N-末端成孔结构域与质膜中的磷酸肌醇结合，并寡聚化生成膜孔，该孔的直径为10～15 nm，足以释放小的炎症细胞因子，包括成熟的IL-1β（直径4.5 nm）和IL-18 （直径5.0 nm）通过，以缓慢的速率释放。与此同时，钠进入细胞，细胞内渗透压增大，导致细胞體积增加，这可能会迅速超过膜的体积容量，导致膜破裂，所有剩余的细胞内炎性物质瞬间释放，从而触发细胞焦亡[17～18]。这证明了GSDMD对于细胞裂解和炎症反应扩大的必要性。所以GSDMD也被称为焦亡的“执行者”，被认为是促进炎症和对抗细菌感染的中枢。GSDMD孔对含有甘油支架（心磷脂）或磷酸化头部基团（磷脂酰肌醇磷脂）上有双磷酸盐脂质的脂质体具有亲和力，由于磷脂酰肌醇蛋白聚糖被限制在质膜的胞质小叶内，所以GSDMD只能从胞质表面形成孔。因此，相邻细胞受到保护，免受来自相邻细胞的GSDMD的作用[17]。LN中沉积的免疫复合物来源包括循环抗核抗体、抗1q抗体、交叉反应抗肾小球自身抗体和中性粒细胞胞外杀伤网络（NETs）等[19]。KAHLENBERG等[3]发现，NETs中含有自身DNA和其他分子，如抗菌蛋白LL-37，在狼疮的发病机制中发挥作用。NETs和LL-37都可激活巨噬细胞中的NLRP3炎症小体，导致IL-1和IL-18的释放，从而诱导细胞焦亡，GSDMD成孔蛋白可通过不同机制促进NETs形成释放[20]，产生更多的NETs，并导致狼疮的复发和器官损害。

    2.3?Caspase-1

    Caspase-1是一种炎症介导的多功能蛋白酶，可介导宿主对感染性疾病的防御，并调节自身炎性疾病、组织修复和细胞存活等[21]。在焦亡过程中，NLRP3的PYD结构域桥接到Caspase-1募集结构域（CARD）相互作用，随后将炎症小体组装成能够激活Caspase-1的轮状结构，Caspase-1二聚化激活，诱导焦亡将IL-1β前体和IL-18前体加工成活性成熟形式，并分泌出来。Caspase-1是炎症小体的中心酶，在狼疮的普里什蒂纳模型中，Caspase-1缺乏可减少血管功能障碍，血管功能障碍是人类狼疮死亡的主要原因[22]。研究表明Caspase-1对于维持和可能的扩展普里什蒂纳暴露后的边缘区B细胞群是必需的。边缘区B细胞群能够产生对循环的抗体反应，在易患狼疮的小鼠中扩大并分泌抗dsDNA抗体[23]，在易患狼疮的MRL/脂多糖受体小鼠中，通过降低活性Caspase-1水平可抑制肾脏NLRP3炎症小体的启动和活化，并降低了蛋白尿、血尿素氮、血清抗dsDNA水平和减少肾脏免疫复合物沉积[24]。与健康人相比，SLE患者Caspase-1表达水平显著增加，并与疾病活动度呈正相关，且LN患者的Caspase-1的基因和蛋白表达明显高于无肾脏损害的SLE患者[14，25]，由此表明高Caspase-1表达与SLE和LN的发病机制有关。此外[14]，已经进一步证实在SLE患者中，dsDNA与Toll样受体4 （TLR4）相互作用，并诱导单核细胞和巨噬细胞线粒体产生活性氧，最终导致Caspase-1高表达。在KAHLENBERG等诱导的狼疮模型中，缺乏Caspase-1的小鼠可防止狼疮自身抗体的发展，被保护免于发展为SLE和LN[26]。以上研究结果证明，Caspase-1在LN的发病机制中有重要意义。

    2.4?IL-1β

    IL-1β是一种促炎细胞因子，属于IL-1家族的一员。IL-1是一种无活性的胞质前体（前体蛋白-1，p35），必须被炎性半胱氨酸蛋白酶切割以产生成熟的活性形式，释放出IL-1β（也称为p17）蛋白[27]。在释放后IL-1β与IL-1受体结合，激活核因子-κB信号通路，释放促炎介质包括环氧合酶-2（COX-2）和干扰素-γ（IFN-γ），以协调免疫反应。IL-1β和IL-18可通过多种机制影响先天免疫和适应性免疫，这些机制极大地有助于宿主对感染病原体的反应。在SLE患者的外周血单个核细胞中可发现IL-1β表达增加[28]，提示该细胞因子可能参与了SLE的发病机制。IL-1β可以增强B细胞对产生自身抗体的浆细胞的增殖和分化，并介导B细胞凋亡，使更多的自身抗原暴露，导致SLE自身抗体（如抗dsDNA抗体 ）的产生[29]。机体自身dsDNA可通过激活NLRP3炎症小体，诱导依赖于血清或纯化的抗dsDNA抗体的人单核细胞产生IL-1β。用dsDNA及其抗体刺激的人单核细胞，可发现核因子-κB通路被高度活化，前IL-1β基因和蛋白的产生增加。IL-1受体拮抗剂可以通过抑制IL-1的作用来防止狼疮的发展。在IL-1β缺乏的小鼠中很难诱发狼疮的事实间接表明IL-1β在SLE[30]的发病机制中具有不可替代的作用。LN患者肾小球内皮细胞和系膜细胞中核因子-κB的表达和激活上调，同时IL-1β等炎症因子升高，核因子-κB的激活与LN的严重程度密切相关[31]。IL-1β已被证明能抑制足细胞中Nephrin启动子的活性和Nephrin的转录[32]，Nephrin表达的下调可能干扰足细胞作为过滤屏障的完整性，在易患狼疮的NZM2328小鼠中，肾小球中的IL-1β由足细胞产生[33]。这提示IL-1β可能在足细胞损伤和肾脏损害发挥重要的作用。

    2.5?IL-18

    IL-18是通过核转录因子κB和核转录因子活化蛋白激酶信号传导的促炎细胞因子，在结构、受体利用和细胞因子加工方面与IL-1相似。IL-18前体是IL-18的非活性前体，储存在细胞内，被Caspase-1切割和加工成具有生物活性的炎症细胞因子IL-18，并被释放到细胞外环境。IL-18的基本功能包括：刺激T细胞和NK细胞产生IFN-γ，增加对Th1、IL-2、IFN-γ和颗粒细胞集落刺激因子的调节;刺激活化的T细胞增殖。IL-18可诱导干扰素-g（IFN-g）的产生，IFN-g可能通过上调CD40和激活人狼疮中的细胞免疫反应[34]，对弥漫性增生性肾小球肾炎的发病机制有贡献。MRL-Faslpr小鼠自发地发展成以大量自身抗体为特征的系统性自身免疫性疾病，可出现肾脏损害、皮肤病变、脾肿大、关节炎和血管炎，与人类SLE非常相似，编码MRL-Faslpr小鼠IL-18前体的cDNA可减少淋巴细胞增殖、干扰素生成和肾损害，并延长MRL-Faslpr小鼠的存活时间[35]。人类和实验模型表明，LN是一种由Th1介导的疾病。IL-18作为Th1细胞因子，可促进Th1淋巴细胞的增殖。IL-18可在LN患者的肾小球中被检测到，推断肾小球IL-18可通过吸引大多数IL-18受体阳性细胞（包括树突状细胞等）而局部增强免疫反应[34]。而且当SLE患者肾脏受累时，血清IL-18水平升高，而其他器官受累对血清IL-18的平均水平没有显著影响[36]。在LN患者的外周血和肾脏中，IL-18表达水平不仅高于健康人，其表达水平与疾病活动和肾脏受累程度相关[37]，与SLEDAI评分和尿蛋白正相关，对LN的复发具有预测价值。以上研究提示了IL-18与肾脏局部炎症反应有关，IL-18是LN疾病活动性的标志。

    3?小結和展望

    危险信号激活炎症小体，活化Caspase-1，切割GSDMD蛋白，导致质膜成孔破裂，释放IL-1β、IL-18等因子触发细胞焦亡，以上细胞焦亡过程相关炎症因子正在成为LN的发病机制中的重要角色。深入研究细胞焦亡过程，通过靶向调控焦亡相关炎症因子表达，抑制焦亡过程，似乎是对LN有希望的一种治疗途径。但目前对于焦亡相关炎症因子的测定都是通过间接的检测方法，希望有更多的直接检测的方法论证细胞焦亡相关炎症因子作用于LN的发病，为临床的诊断和治疗提供新的策略。

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    （收稿日期：2020-05-04?修回日期：2020-05-30）

    （編辑：梁明佩）