hPlGF-2基因修饰的骨髓间充质干细胞对皮肤创伤修复及血管形成的作用研究

2022.08.05

陈金逸陈宗存饶朗毓黄亚莲符茂雄

[摘要]目的：構建胎盘生长因子hPlGF-2基因腺病毒载体，探讨hPlGF-2修饰的骨髓间充质干细胞（Bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）对SD大鼠皮肤愈合的影响。方法：分离培养SD大鼠BMSCs细胞，PCR 法扩增hPlGF-2基因DNA片段，并构建pAdTrack-hPlGF-2重组载体;重组腺病毒pAd/hPlGF-2感染 BMSCs后，倒置显微镜观察EGFP表达情况，PCR与Western blot分别检测hPlGF-2 mRNA和蛋白的表达，MTT法检测BMSCs增殖;构建SD大鼠皮肤割伤模型，以创缘注射感染重组腺病毒pAd/hPlGF-2的 BMSCs为实验组，以创缘注射生理盐水为对照组，HE染色观察创面病理形态变化，免疫组织化学法检测带EGFP（+）的BMSCs在创面的分布情况。结果：成功构建了腺病毒载体 pAdTrack-hPlGF-2，在hPlGF-2基因修饰的BMSCs中检测到了hPlGF-2 mRNA与蛋白的表达，且感染重组腺病毒pAd/hPlGF-2对BMSCs的增殖能力无影响。在大鼠皮肤创面注射hPlGF-2基因修饰的BMSCs后，创面感染程度较轻，愈合速度较快，在创伤后7d和14d观察到EGFP标记的BMSCs出现在创面血管周围和血管内皮处，同时有FⅧ表达。在创伤后7d新生肉芽组织中，bFGF的表达明显增加。结论：hPlGF-2基因修饰的BMSCs能分化为成纤维细胞参与到皮肤创面修复中，并分化为血管内皮细胞参与血管的再生。

[关键词]骨髓间充质干细胞;腺病毒载体;重组质粒;胎盘生长因子;基因修饰;创伤愈合

[中图分类号]R622? ? [文献标志码]A? ? [文章编号]1008-6455（2020）10-0106-05

Eeffect of hPlGF-2 Gene Modified BMSCs on Skin Wound Repair

and Angiogenesis

CHEN Jin-yi，CHEN Zong-cun，RAO Lang-yu，HUANG Ya-lian，FU Mao-xiong

（Department of Endocrinology，the Second Affiliated Hospital of Hainan Medical College，Haikou 570311，Hainan，China）

Abstract： Objective? An adenoviral vector of placental growth factor hPlGF-2 gene was constructed， and the effect of hPlGF-2 modified bone marrow mesenchymal stem cells （BMSCs） on skin healing in SD rats was investigated. Methods? Isolate and culture SD rat BMSCs cells， amplify the hPlGF-2 gene DNA fragment by PCR， and construct the pAdTrack-hPlGF-2 recombinant vector; After infecting BMSCs with recombinant adenovirus pAd/hPlGF-2， observe the expression of EGFP by an inverted microscope. PCR and Western blot were used to detect the expression of hPlGF-2 mRNA and protein. MTT method to detect BMSCs proliferation; A model of SD rat skin cut was established. BMSCs infected with recombinant adenovirus pAd/hPlGF-2 were injected into the wound margin as the experimental group， and saline was injected into the wound margin as the control group. HE staining was used to observe the pathological changes of the wound. The distribution of BMSCs with EGFP（+） on the wound was detected by immunohistochemistry. Results? The adenoviral vector pAdTrack-hPlGF-2 was successfully constructed， hPlGF-2 mRNA and protein expression was detected in hPlGF-2 gene-modified BMSCs， and infection with recombinant adenovirus pAd/hPlGF-2 had no effect on the proliferation capacity of BMSCs. After injecting hPlGF-2 gene-modified BMSCs into rat skin wounds， the wound infection was milder and healed faster. EGFP-labeled BMSCs were observed around the blood vessels and endothelial endothelium at 7 and 14 days after trauma. At the same time， FVIII is expressed. The expression of bFGF was significantly increased in the new granulation tissue at 7 days after wounding. Conclusion? The hPlGF-2 gene-modified BMSCs can participate in the repair of skin wounds. It is speculated that they differentiate into vascular endothelial cells and participate in the regeneration of blood vessels.

Key words： bone marrow mesenchymal stem cells （BMSCs）; adenovirus vector; recombinant plasmid; placental growth factor? （PlGF）; gene modification; wound healing

由于创伤、放射或遗传性疾病等各种原因导致的皮肤缺损，创面局部微环境较差，导致创面感染、愈合延迟、难愈或不愈等，是临床治疗面临的一大难题[1-3]。创面愈合过程与多种因素有关，并涉及细胞分子之间的复杂相互作用[4]。而在创面愈合时新生血管形成十分重要，血管内皮生长因子-A（VEGF-A）具有较强的促血管再生与神经再生功能，是研究较早且较为成熟的一种促血管生长因子[5-6]。对VEGF家族的另一成员，即胎盘生长因子（PLGF），也具有强烈的促进血管生长的作用，且作用效果更为持久，而关于hPLGF2在皮肤损伤后血管形成方面的相关研究尚未见报道。

骨髓间充质干细胞（Bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）是来源于中胚层且具有分化能力的干细胞，在一定诱导条件下BMSCs具有向成骨细胞、成肌细胞、脂肪细胞以及基质细胞等中胚层细胞分化的能力[7]。目前，已有诸多研究证明，BMSCs对骨、肌肉、心血管系统及神经系统等的损伤均具有促修复的作用[8-10]。随着研究的深入，BMSCs在创面愈合中的作用越来越受到关注，BMSCs能够分泌与创面愈合有关的细胞因子或分化为创面修复细胞等机制能够发挥促进创面愈合的作用[9，11-12]。本研究拟通过构建腺病毒载体pAdTrack-hPlGF2，探讨hPLGF2基因修饰的BMSCs在损伤后的大鼠皮肤血管形成中的作用及其可能机理，这将有助于为临床创面愈合治疗提供新思路。

1? 材料和方法

1.1 材料和试剂

1.1.1 主要试剂：DMEM/F12培养基、胰蛋白酶与Percoll 分离液购于美国Sigma公司;鼠抗EGFP、兔抗FⅧ、兔抗bFGF、兔抗hPlGF-2、兔抗GAPDH、鼠抗兔TRITC、山羊抗鼠FITC，羊抗兔 IgG等抗体购于美国Millipore公司;Sal Ⅰ、Hind Ⅲ、Kpn Ⅰ、Pme Ⅰ、Pac Ⅰ酶、 pTG19-T表达载体和pAdTrack-CMV 穿梭载体购于美国Invitrogen公司，胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒购于瑞士Roche公司;反转录试剂盒、Tag酶、感受态大肠杆菌 DH5α购于日本Takara公司;Lipofectamine2000、MTT试剂盒，HE染色试剂盒与RIPA 裂解液购于上海碧云天生物技术有限公司。

1.1.2 动物：SPF级健康雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠（100±10）g购于海南医学院动物实验中心。

1.2 方法

1.2.1 大鼠骨髓间充质干细胞的分离与培养：颈椎脱臼处死成年SD大鼠并取双侧胫骨和股骨，使用DMEM/F12培养基冲洗骨髓腔，在悬液加入含Percoll分离液，1 000rpm离心10min后，吸取白膜层并加入含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基重悬，置于37℃、5% CO2培养箱中进行培养。24h后更换培养液，弃悬浮细胞，之后每隔3d更换一次培养液。当细胞生长融合达培养瓶90%时，用0.25%胰蛋白酶消化传代。本实验使用第三代BMSCs。

1.2.2 hPlGF-2基因表达腺病毒载体的构建：①hPlGF-2基因的克隆、克隆载体pTG19-T/hPlGF-2的构建与鉴定：设计 hPlGF-2基因的扩增引物，上游：5-CTGTCTGCTGGGAACAACTCAA-3，下游：5'-TCCTTTCTGCCTTTGT CGTCTC-3'，以pBLAST49-hPlGF-2质粒为模板，PCR扩增hPlGF-2基因片段。將PCR产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳，胶回收试剂盒回收产物，将产物与pTG19-T表达载体连接，转化感受态大肠杆菌 DH5α，并将阳性克隆送至上海生物工程有限公司进行测序鉴定，经鉴定正确的质粒命名为pTG19-T/hPlGF-2;②hPlGF-2基因腺病毒pAdTrack-CMV穿梭载体的亚克隆及鉴定：腺病毒穿梭载体 pAdTrack-CMV与pTG19-T/hPlGF-2经限制性内切酶Hind Ⅲ、Kpn Ⅰ切割后，回收产物后连接，转入感受态大肠杆菌DH5α内，挑取抗性克隆，使用质粒提取试剂盒提取该质粒，进行双酶切（Hind Ⅲ、Kpn Ⅰ）与测序鉴定，经鉴定正确的质粒命名为 pAdTrack-hPlGF-2。

1.2.3 重组腺病毒的包装和病毒滴度的测定：pAdTrack-hPlGF-2载体质粒经Pme Ⅰ酶线性化后，转入含pAdTrack质粒的感受态大肠杆菌 DH5α中进行同源重组，得到的重组腺病毒命名为pAd/hPlGF-2，用Pac Ⅰ酶切pAd/hPlGF-2病毒质粒，并进行电泳检测，利用酚氯仿抽提法纯化质粒。以转染试剂Lipofectamine2000介导纯化的pAd/hPlGF-2质粒转染293T细胞进行包装，转染5h后去除含病毒培养基，更换新鲜10%胎牛血清的DMEM/F12培养基继续培养，并观察293T细胞病变情况。当细胞有明显病变时，将上清液收集于离心管中，37℃和-80℃反复冻融3次，12 000r/min离心5min，收集上清，继续转染293T细胞。经8轮传代扩增，将第8代病毒以倍比稀释法测定病毒滴度。

1.2.4 重组腺病毒感染BMSCs：将BMSCs以每孔6×106个接种于6孔板，每孔加入滴度7×109 PFU/ml的重组腺病毒pAd/hPlGF-2 500μl，在37℃、5% CO2培养箱中培养48h后弃病毒液，加入含10%胎牛血清的DMEM/F12培养液继续培养，倒置荧光显微镜下观察EGFP的表达情况并拍照。

1.2.5 PCR反应：使用TIRzol试剂盒提取感染后BMSCs的总RNA，以总RNA为模板进行反轉录，通过PCR法在mRNA水平检测hPlGF-2基因的表达情况，以空病毒pAdTrack-CMV感染48h的BMSCs总RNA为模板的检测作为对照。扩增结束后使用1.5%琼脂糖凝胶电泳进行检测PCR产物。

1.2.6 Western blot检测：RIPA裂解缓冲液提取感染后BMSCs的总蛋白，BCA法进行蛋白浓度测定，10% SDS-PAGE电泳分离蛋白，切胶并转移至PVDF膜，5%脱脂奶粉室温封闭2h，加入兔抗hPlGF-2（1：1 000）、兔抗GAPDH（1：1 000）在4℃下孵育过夜。PBS洗涤PVDF膜后，将其与HRP 标记的二抗（1：5 000）常温孵育1h，洗膜并滴加ECL发光液进行曝光，使用Image-Pro Plus 6.0分析蛋白质灰度值。

1.2.7 MTT法：将正常BMSCs、pAdTrack-CMV空载体感染的BMSCs及重组腺病毒pAd/hPlGF-2感染的BMSCs，以每孔1×105个接种于96孔板，于37℃、5% CO2培养箱中孵育，在培养24、36、48、72、96h加入0.5%二苯基溴化四氮唑蓝（MTT）混合均匀，继续孵育6h后每孔加入二甲基亚砜（DMSO），使用酶标仪测定波长490nm处的光密度（OD）值。

1.2.8 大鼠切割伤模型制备：SD大鼠以0.4%戊巴比妥钠进行腹腔注射麻醉，背部皮肤去毛，使用0.5%碘伏消毒，在大鼠背部两侧分别切除部分全层皮肤，达深筋膜，直径在1.2cm左右，建立全层皮肤损伤模型。模型完成后，取200μl重组腺病毒pAd/hPlGF-2感染的BMSCs悬液局部多点注射至创缘，对照组大鼠在相同部位注射等量的生理盐水。

1.2.9 HE染色：造模致伤后7d、14d，在无菌条件下取创缘及正常交界处组织，PBS冲洗，经4%多聚甲醛固定，常规石蜡包埋后，制成4μm的石蜡组织切片，苏木精染色5min，流水冲洗后，伊红染色液染色3min，脱水、透明、封片，于电子显微镜下观察并拍照。

1.2.10 免疫组织化学：造模致伤后7d取创缘新生肉芽组织制成常规石蜡切片，脱蜡至水，3% H2O2+甲醇溶液去除内源性过氧化物酶，0.01mol/L枸椽酸盐缓冲液95℃水浴30 min进行抗原修复，待冷却至室温后加第一抗体鼠抗EGFP（1：100）、兔抗FVIII（1：100），兔抗bFGF（1：500） 4℃过夜，PBS 冲洗，加第二抗体鼠抗兔TRITC（1：200）、山羊抗鼠FITC（1：200）或羊抗兔 IgG（1：1 000）室温孵育30min后：①PBS冲洗，加DAPI复染细胞核，封片，在荧光显微镜下观察EGFP和FVIII表达并拍照;②PBS冲洗，加DAB显色后，经苏木素复染，脱水、透明、封片，在显微镜下观察bFGF表达并拍照。

1.3 统计学分析：采用SPSS 20.0软件进行统计分析，数据以均数±标准差表示，数据进行独立样本t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2? 结果

2.1 重组腺病毒载体pAdTrack-hPlGF-2的获得与鉴定：PCR扩增获得长度为921bp的hPlGF-2基因片段，该片段插入pTG19-T载体克隆后，将酶切获得的hPlGF-2基因片段与pAdTrack-CMV穿梭载体连接得到的重组质粒，经双酶切鉴定，电泳条带中有一条大小为921bp，表明重组腺病毒载体pAdTrack-hPlGF-2构建成功。见图1。

2.2 重组腺病毒pAd/hPlGF-2的包装和病毒滴度的测定：重组腺病毒pAd/hPlGF-2经293T细胞包装24 h后，倒置荧光显微镜观察见明显的 EGFP表达，包装后7d，胞体肿胀变圆、核增大（见图2）。病毒细胞经8轮传代与扩增以提高其滴度，以倍比稀释方法检测到病毒滴度为7×109TU/ml。

2.3 重组腺病毒pAd/hPlGF-2感染BMSCs后EGFP表达检测：如图3所示，重组腺病毒pAd/hPlGF-2感染BMSCs 48h后，倒置荧光显微镜观测到未感染pAd/hPlGF-2病毒的正常BMSCs不表达EGFP，经pAd/hPlGF-2病毒感染的BMSCs中EGFP的明显表达。

注：A.正常BMSCs细胞;B.经重组腺病毒pAd/hPlGF-2感染48h的BMSCs细胞

2.4 重组腺病毒pAd/hPlGF-2感染BMSCs后hPlGF-2 mRNA和蛋白水平检测：以感染重组腺病毒pAd/hPlGF-2 48h的BMSCs总RNA为模板，在mRNA水平检测到 hPlGF-2基因片段的表达，而在空病毒感染的BMSCs中未检测到表达（见图4）。同样，在感染重组腺病毒pAd/hPlGF-2 48h的BMSCs检测到了hPlGF-2蛋白的表达，而在空病毒感染的细胞中未检测到（见图5）。

2.5 重组腺病毒pAd/hPlGF-2对BMSCs增殖能力的影响：MTT法检测正常组、空载体组及重组腺病毒pAd/hPlGF-2感染组细胞增殖能力，结果显示，三组细胞的光密度值均随着时间的延长出现递增的趋势（见图6）。数据分析结果表明，重组腺病毒感染组与正常组、重组腺病毒感染组和空载体组之间相比较，细胞增殖能力无显著性差异（P>0.05），见表1。说明感染重组腺病毒pAd/hPlGF-2对BMSCs的生长无刺激或抑制作用。

2.6 hPlGF-2基因修饰BMSCs对皮肤愈合的影响：大鼠皮肤创伤造模后7d和14d均观察到：注射重组腺病毒pAd/hPlGF-2感染的BMSCs悬液的创面肉芽组织丰富，创缘开始有较厚的新生表皮向创面移行生长;而对照组肉芽组织含量相对较少，创面无明显愈合现象（见图7）。说明注射重组腺病毒pAd/hPlGF-2感染的BMSCs后加速了创面愈合。

注：A.注射生理鹽水的创面（对照组）;B.注射重组腺病毒pAd/hPlGF-2感染的BMSCs悬液的创面

第7天和第14天，在创缘新生肉芽组织切片中可见 EGFP的阳性细胞，同时观察到FⅧ的阳性细胞，并且多数聚集在真皮层、血管周围及血管内皮处（见图8）。说明移植的BMSCs可以在创面定植，并分化为能够表达FⅧ的血管内皮细胞。

在第7天观察到对照组和实验组都有bFGF表达，但与对照组相比，注射重组腺病毒pAd/hPlGF-2感染的BMSCs悬液的新生肉芽组织中的bFGF表达较为显著（见图9）。说明BMSCs 在创面定植并可以分化为成纤维细胞，以促进创面愈合。

3? 讨论

皮肤创面愈合是一个复杂的生物学过程，分为炎症反应、肉芽组织增生、创面再上皮化及创面愈合后的改建等过程[13]。局部给予外源性生长因子在创面愈合环境中呈现出半衰期短、生物利用度低、成本高、需重复给药等缺点，随着细胞分子生物学、组织工程学及DNA分子操作技术的进步，通过基因治疗的方法有望为慢性创面的修复带来新的曙光[14-15]。骨髓间充质干细胞（BMSCs）具有强大的可塑性，来源广泛，容易体外大量扩增以及基因修饰，其在慢性难愈创面的治疗作用也逐渐受到广泛关注。

基因修饰的BMSCs不仅能够提供治疗性的修复细胞，而且能够为伤口的正常愈合提供所必需的细胞因子[16]。目前许多研究证实，全身或局部应用BMSCs可以显著提高创面愈合速度和质量。例如，Mcfarlin[17]等将BMSCs局部移植到大鼠全层切割伤创面，发现与对照组比较，BMSCs组显著增强了创面伤口愈合速度。在局部创面微环境的刺激下，BMSCs能表达一些特定的细胞因子，从而调节修复细胞的趋化、增殖以及新生血管形成等来参与创面修复[18]。而且，BMSCs较容易被重组腺病毒转染。腺病毒用作基因治疗载体，具有稳定安全，致病性低，基因容量大，插入位点少，易于大量培养与纯化、感染宿主细胞的类型广等特点[19-20]。本次研究成功克隆了hPlGF-2基因ORF片段，并将此目的片段连接到了pTG19-T载体上以扩增目的片段。随后通过pAdTrack-CMV腺病毒构建系统，成功的构建了重组腺病毒载体pAdTrack-hPlGF-2。经包装的pAd/hPlGF-2在荧光显微镜下能观察到明显的EGFP表达。为了验证腺病毒pAd/hPlGF-2可靠性，将其感染大鼠BMSCs 48h后，在mRNA和蛋白水平均证明hPlGF-2可以成功的过表达。并观察转染过腺病毒的BMSCs状态良好，未发生形变且有EGFP表达。在不同感染时间检测BMSCs增殖能力发现，重组腺病毒pAd/hPlGF-2感染对BMSCs的生长无刺激或抑制作用。

为了验证hPlGF-2基因修饰的BMSCs在血管形成的作用，构建了皮肤割伤模型，在创缘注射了重组腺病毒pAd/hPlGF-2感染的BMSCs悬液，观察hPlGF-2基因修饰的BMSCs在创伤的分布及作用情况。本研究中，hPlGF-2基因修饰的BMSCs表达增强型绿色荧光蛋白（EGFP），在第7天可观察到绿色荧光细胞分布在创面血管周围，到14d仍可观察到绿色荧光，同时，在创伤后7d和14d也均观察到血管内皮细胞表面标志物FⅧ的表达。表明BMSCs能够在创面微环境中定植，并愈合过程中向血管内皮细胞直接转化。碱性成纤维细胞因子bFGF作为重要的促有丝分裂因子，主要功能包括作为血管生长因子和促进创伤愈合与组织修复[21]。通过bFGF染色后发现在hPlGF-2基因修饰的BMSCs注射的新生肉芽组织中bFGF的表达明显增加。bFGF主要分布在成纤维细胞的胞浆中[22]，因此推测BMSCs在局部微环境作用下可能直接分泌细胞外基质参与修复或演变成修复的成纤维细胞。

通过本研究，成功构建了重组腺病毒载体pAdTrack-hPlGF-2并成功制备了hPlGF-2基因修饰的BMSCs，初步验证了在大鼠皮肤创伤面注射hPlGF-2基因修饰的BMSCs可能会加快皮肤愈合。hPlGF-2基因修饰的BMSCs有望应用于促进血管新生、改善创面愈合治疗中。

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[收稿日期]2020-03-09

本文引用格式：陈金逸，陈宗存，饶朗毓，等.hPlGF-2基因修饰的骨髓间充质干细胞对皮肤创伤修复及血管形成的作用研究[J].中国美容医学，2020，29（10）：106-111.