多重巢式固相PCR-Array芯片用于高致病性病原微生物并行检测

    朱灿灿　崔俊生　胡安中　杨柯　赵俊　刘勇　邓国庆　朱灵

    

    

    

    摘 要 提出了一种多重巢式固相PCR的方法，以微流控芯片为载体，采用紫外交联方式将寡核苷酸序列固定在芯片上，构建了阵列式固相PCR-阵列（PCR-Array）芯片，用于细菌和病毒类高致病性病原微生物的并行检测。选择新疆出血热病毒、埃博拉病毒、炭疽杆菌和布鲁氏菌4种代表性高致病性病原微生物为研究对象，通过基因工程手段构建了包含有炭疽杆菌和布鲁氏菌特异性基因片段的重组质粒载体，利用病毒包装技术构建了包含有两种病毒特异性基因片段的逆转录病毒颗粒，完成了4种高致病性病原微生物阳性标准品的制备，并以此作为实验样本，探究了多重巢式固相PCR-Array芯片的制备方法和扩增体系。结果表明，在优化的实验条件下，多重巢式固相PCR-Array芯片检测4种高致病性病原微生物的检出限达10 copy/μL以下量级。本方法灵敏度高，特异性好，同时，引物空间上的隔离避免了相互干扰，提高了检测通量，在多种病原微生物快速并行检测方面具有良好的应用前景。

    关键词 高致病性病原微生物; 多重; 巢式固相PCR-阵列芯片

    1 引 言

    根据物种来源不同，高致病性病原微生物可分为病毒类、细菌类、放线菌、真菌、衣原体、立克次体和螺旋体，其中以病毒和细菌类为主，如病毒类的埃博拉病毒（Ebola）、新疆出血热病毒（克里米亚-刚果出血热病毒， Crimea-Congo hemorrhagic fever virus，CCHFV）和寨卡病毒等; 细菌类如炭疽杆菌（Bacillus anthracis）、布鲁氏菌（Brucella）、鼻疽伯克菌和土拉热弗朗西思菌等[1]。世界卫生组织（WHO）的研究数据显示，高致病性病原微生物引起的传染性疾病是人类发病率和死亡率的重要组成部分，是威胁人类健康和造成社会恐慌的主要因素[2]。建立多种高致病性病原微生物的快速并行检测方法，对提升疫情防控能力具有重要意义[3～5]。

    传统的病原微生物检测方法主要有基于微生物培养的菌落鉴定法和基于特异性抗原抗体结合的免疫学方法[6，7]，这些方法操作复杂、耗时长，需3～4 d才能完成[8]，且灵敏度低，无法满足高致病性病原微生物快速检测的要求[9，10]。基于聚合酶链式反应（PCR）技术的核酸检测方法具有特异性好、灵敏度高、速度快的优势[11～14]，已被广泛应用于病原微生物快速檢测。但普通PCR主要针对多个样品同一个靶点的检测[15]，当面对未知感染源样本时，常需同时对包括细菌和病毒在内的多种病原微生物进行筛查，一次 PCR 反应需要完成多个靶点检测[16～18]。传统的管式多重 PCR由于引物间相互干扰和荧光检测通道有限，一次最多只能同时扩增3～4个目的基因[19]。近年来出现的固相PCR（Solid phase PCR，SP-PCR）解决了不同引物间相互干扰的难题[20，21]; 它通过将特异性引物固定在玻璃基片上，使得扩增后生成的PCR产物锚定在芯片上，避免了多重PCR引物间的干扰，同时增大了通量且不受荧光检测通道限制，可实现多达105个目标基因的并行检测[22～24]。微流控芯片作为新型微纳分析技术平台，将生物和化学等领域所涉及的样品制备、分离与检测等基本操作单元集成在一块数平方厘米的芯片上，具有多种单元技术在整体可控的微小平台上灵活组合、规模集成的特征和优势[25～27]。微流控PCR芯片因其消耗样本少、成本低、升降温速率快等优点[28]，已广泛应用于病原微生物快速检测中。

    本研究将微流控芯片与固相PCR技术相结合，针对细菌类和病毒类高致病性病原微生物快速并行检测的难题，建立了一种多重巢式固相PCR-Array芯片检测新方法。对阵列式芯片制备方法和多重巢式固相PCR反应体系进行了优化，提高了检测的特异性和灵敏度。选用具有代表性的新疆出血热病毒、埃博拉病毒、炭疽杆菌和布鲁氏菌4种高致病性病原微生物作为研究对象，由于缺少真实样品来源，采用人工合成方法制备了炭疽杆菌和布鲁氏菌的DNA重组质粒。同时，利用逆转录重组病毒技术构建了包含有新疆出血热病毒和埃博拉病毒特异性基因序列的逆转录病毒颗粒，模拟了真实RNA类病毒在PCR扩增中的逆转录过程，建立了基于多重巢式固相PCR-Array芯片的4种高致病性病原微生物检测方法。结果表明，本方法灵敏度达10 copy/μL以下量级，具有特异性好、灵敏度高、反应速度快等优势，在临床诊断、环境污染监测和防治生物突发事件等方面具有广阔的应用前景。

    2 实验部分

    2.1 仪器与试剂

    CL-1000紫外交联仪（德国Analytikjena公司）; Nanodrop-2000超微量紫外分光光度计（美国Thermo Scientific公司）; 5804R高速离心机（德国Eppendorf公司）; 等离子体清洗机（美国Harrick Plasma 公司）; 生物安全柜（新加坡Esco公司）; ADV-I0006芯片点样仪（博奥公司）; 微流控荧光PCR仪（自行研制）[29]; 实时荧光定量PCR仪LightCycle96（瑞士罗氏公司）; 纯水机（摩尔公司）; CO2培养箱（博讯公司）。

    聚二甲基硅氧烷（Polydimethylsiloxane， PDMS）前体和固化剂（Sylgard 184， 美国DowCorning公司）; 柠檬酸钠缓冲液（SSC）、十二烷基硫酸钠（SDS）、PUC57人工质粒载体（上海生物生工有限公司）; Probe qPCR Mix、Bgl II/XhoI内切酶（TaKaRa公司）; 逆转录病毒载体pDON-5、pGP和pE-ampho（TaKaRa（中国）公司）; 新疆出血热病毒、埃博拉病毒、炭疽杆菌和布鲁氏菌特异性基因片段及引物均由上海生物生工有限公司合成，引物序列见表1。

    2.2 实验方法

    2.2.1 炭疽杆菌、布鲁氏菌重组质粒和新疆出血热、埃博拉逆转录病毒颗粒的构建 在NCBI数据库中，查找新疆出血热病毒、埃博拉病毒、炭疽杆菌以及布鲁氏菌4种病原微生物各分型的序列信息，通过序列比对，获得各病原微生物的保守性序列，以该序列作为目的片段，用来筛查和检测4种病原微生物。由上海生工生物工程有限公司合成以上4种特异性片段，并将其分别连接到PUC57克隆载体上，以此载体转化大肠埃希菌DH5α，经纯化后制成重组DNA质粒，依次命名为PUC57-CCHFV、PUC57-Ebola、PUC57-Bacillus anthracis、PUC57-Brucella。分别将PUC57-CCHFV、PUC57-Ebola质粒和逆转录病毒载体pDON-5进行Bgl II/XhoI双酶切，纯后化回收进行连接，制备成重组逆转录病毒载体pDON-CCHFV和pDON-Ebola，经培养鉴定后，与病毒包装载体pGP和pE-ampho共转染293T细胞（提前置于37℃、5% CO2条件下静止培养24 h）， 48 h后收集细胞培养上清液，经DNase酶消解后，提取RNA，通过实时荧光RT-PCR鉴定是否完成逆转录病毒颗粒的包装，反应体系包括：上下游引物各1 μL、RT-PCR mix 10 μL， 模板2 μL、二次去离子水6 μL，共计20 μL。RT-PCR反应程序设置如下： 50℃运行15 min后， 以95℃运行15 s， 55℃运行30 s，72℃运行45 s为1个循环，运行40个循环。

    2.2.2 固相PCR-Array芯片制作 利用三维设计软件Solidworks设计出芯片模板的数字模型，采用机械精加工方式制作铜质芯片模具。因聚二甲基硅氧烷（PDMS）具有优良的光学特性、良好的生物兼容性、较高的热稳定性，是微流控芯片制备中使用较多的聚合物材料。将PDMS 前聚体与固化剂按质量比10∶1混合，于真空箱中除去气泡，浇注到模具表面，95℃固化3 h，脱模后形成PDMS基片。将玻璃片（25 mm×25 mm）浸泡在浓H2SO4-H2O2混合液（10∶1， V/V）中15 min，取出，用大量去离子水冲洗干净，去除表面污渍。使用芯片点样仪将固相引物以微阵列形式点至玻璃片表面，单个圆点直径0.5 mm，点间距1.2 mm。自然晾干后，将玻璃片放置于波长为254 nm的紫外交联仪中进行固化，取出玻璃片，使用0.1×SSC 和0.1% SDS混合液冲洗，再使用去离子水多次冲洗，除去未交联上的引物序列。晾干后，将PDMS基片与固定有引物序列的玻璃片共同放置于氧等离子体清洗机中处理45 s后，立刻取出键合，完成固相PCR-Array芯片制作。

    引物固定采用紫外交联方式进行，由于引物序列上连接有一段TC寡聚核苷酸序列，在紫外光作用下可固定于玻璃片表面，且在高温条件下，仍具有较高的稳定性。固相引物交联时间设置2～12 min，共11个梯度，浓度分别为50 μmol/L和100 μmol/L，探究两种固定引物浓度下，固相PCR-Array芯片制作中引物的最佳固定时间。

    2.2.3 多重巢式固相PCR体系优化实验 将浓度分别为25、50、75、100、125和150 μmol/L的固相引物序列固定于芯片上，同时，将上下游引物浓度比分别设置为4∶1和2∶1，探究不同引物浓度组合对多重巢式固相PCR-Array芯片扩增效率的影响。该部分优化实验，以5.62×104 copy/μL的埃博拉病毒阳性标准品RNA为模板，反应体系如下：游离上下游引物各1 μL、RNA 2 μL、RT-PCR Mix 10 μL、ddH2O 6 μL，共20 μL。在微流控熒光PCR仪上采用如下反应条件进行RT-PCR温度设置如下： 42℃逆转录5 min， 95℃退火10 s; 巢式SP-PCR第一阶段： 95℃ 10 s， 55℃ 30 s， 72℃ 30 s， 25 cycles; 巢式SP-PCR第二阶段： 95℃ 20 s， 62℃ 30 s， 72℃ 30 s，? 20 cycles。反应结束后，使用0.1×SSC 和0.1% SDS混合液冲洗反应腔。使用自行研制的微流控荧光PCR仪对芯片的检测结果进行成像，通过Image J分析软件对芯片上相应荧光点（每个点重复6次）的灰度值进行数据统计和分析，然后使用OrignPro8.0处理数据。

    2.2.4 多重巢式固相PCR-Array芯片检测4种病原微生物的特异性和灵敏度实验 分别以浓度为104 copy/μL量级的4种病原微生物阳性样本为模板，进行多重巢式固相PCR实验，扩增程序设置如2.2.3节所述，验证多重巢式固相 PCR-Array芯片检测4种病原微生物的特异性。依次将4种病原微生物阳性样本进行10倍梯度稀释，使其终浓度为105～100 copy/μL量级，并以此为模板，进行巢式固相PCR反应，扩增条件设置和数据处理方法同2.2.3节，验证多重巢式固相 PCR-Array芯片的检测灵敏度。

    3 结果与讨论

    3.1 检测原理

    由于固相PCR将扩增反应中的一条引物序列固定在玻璃基片上，使得固相引物利用率较低，因此，固相PCR相对于液相PCR，其检测灵敏度低，且易出现因引物二聚体导致检测结果的假阳性，因而限制了固相PCR的广泛应用。本研究在传统固相PCR基础之上，结合微流控芯片，提出了多重巢式固相 PCR-Array芯片技术，检测原理如图1所示。连有一段poly（T）10-poly（C）10序列的固相引物通过紫外交联方式固定在微流控芯片表面，在PCR扩增的第一阶段，游离在反应体系中的上下游引物在低退火温度下与DNA模板结合并扩增，生成带有荧光标记的扩增产物; 在PCR扩增的第二阶段，以第一阶段的PCR产物为模板，同时，提高退火温度，利用芯片上的固相引物进行扩增，使得新生成的产物固定在玻璃基片上。随着PCR循环数增加，芯片上各固定点积累的产物量也随之增多，待反应结束后，通过检测各固定点荧光信号，实现待测病原微生物的检测。巢式固相PCR扩增方法将PCR过程分成两个阶段进行，并在第一阶段扩增反应中增加了一条引物，达到富集目标基因的目的; 再通过第二阶段PCR扩增反应中固相引物的引入，使得扩增产物固定在芯片上 ，提高了检测灵敏度及特异性。本研究仅选择4种具有代表性的高致病性病原微生物作为检测对象，但根据筛查范围需要，可同时将几十个甚至几百个筛查位点固定在芯片上，在一张芯片上即可完成多种病原微生物的同时检测，具有检测速度快、通量高和节省试剂的优势。

    3.2 固相PCR-Array芯片制备方法对扩增效率的影响

    固相PCR-Array芯片是多重巢式固相PCR检测方法的核心。大量研究表明，不同的引物固定方法是影响固相PCR扩增效率的关键因素之一[28]。本研究采用紫外交联法将带有poly（T）10-poly（C）10寡核苷酸序列的引物固定在芯片上，若交联时间过短，引物不能完全固定在芯片上，固相引物量较少，影响巢式PCR第二阶段的扩增效率; 若交联时间过长，紫外线会对寡聚核苷酸序列造成损伤，碱基间磷酸二酯键断裂，导致碱基缺失，使得扩增不能正常进行。 分别以浓度为50和100 μmol/L的固相引物为测试对象，以5.62×104 copy/μL埃博拉病毒阳性标准品的RNA为模板，探究两种浓度下引物的最佳固定时间。 实验结果如图2A所示，随着交联时间的持续增长，固定在芯片上的引物量增多，多重巢式固相PCR产物累积量也越多，荧光强度也越高。通过计算各固定点的荧光数值，绘制曲线（图2B）。结果表明，在一定紫外交联时间范围内，多重巢式固相RT-PCR扩增效率可能受到固相引物不足的限制，增长紫外交联时间，可以增大芯片上固定引物的数量，因此可以提高固相PCR扩增效率。然而，当紫外交联时间高于一定限度时，芯片上固定的引物量达到饱和，再增长时间，并不会影响甚至会抑制巢式固相PCR扩增。为了保证多重巢式固相PCR反应充分及扩增效率，选择9 min作为固相引物固定时间，用于制作固相PCR-Array芯片。

    3.3 多重巢式固相PCR体系优化

    引物浓度也是影响固相PCR扩增效率及检测限的主要因素之一[30]。在本研究建立的多重巢式固相PCR方法中，液相引物以一定比例存在于PCR反应体系中; 若液相上下游引物比值过高，说明上游引物过多，而带有荧光标记的下游引物较少，在巢式固相PCR的第二阶段中，上游引物会竞争抑制固相引物与模板的结合，因此影响第二阶段的扩增效率; 若液相上下游引物比值过低，则直接影响第一阶段液相PCR扩增效率，使得第一阶段扩增产物量较少，影响巢式固相PCR终产物数量。另外，由于固相PCR是通过检测固定点的荧光信号实现待测目标的判定，因此，固相引物浓度直接影响了巢式固相PCR方法的检出限。 本研究将浓度为25～150 μmol/L的引物固定在芯片表面，以5.62×104 copy/μL埃博拉病毒阳性标准品的RNA为模板，在游离液相上下游引物浓度比值分别是1∶4和1∶2条件下， 经巢式固相RT-PCR扩增后，比较不同引物浓度组合下，芯片上固定产物的荧光强度。

    如图3A所示，当液相上下游引物浓度比值为1∶4时，随着固相引物浓度的持续升高时，经固相RT-PCR扩增后，荧光强度持续增强，在固相引物浓度为100 μmol/L时达到最大值; 但随着引物浓度持续增加（100～150 μmol/L），荧光强度呈下降趋势，这表明持续增加固相引物浓度不能提高固相RT-PCR扩增效率及扩增产物数量。因此，本研究确定固相引物最适浓度为100 μmol/L。

    同时，在游离液相上下游引物浓度比值分别是1∶4和1∶2条件下（图3B），当固相引物浓度较低时（<100 μmol/L），液相上下游引物浓度比值为1∶2的反应体系扩增效率更高，固定点荧光强度较高; 但当固相引物浓度较高（≥100 μmol/L）时， 液相上下游引物浓度比值为1∶4的反应体系扩增效率更高，固定点荧光强度显著增强。因此，本研究确定固相引物浓度为100 μmol/L，液相上下游引物浓度比值为1∶4， 此时巢式固相RT-PCR扩增效果最佳。

    3.4 多重巢式固相PCR-Array芯片检测4种高致病性病原微生物的特异性和灵敏度

    通过优化多重巢式固相PCR扩增体系及固相PCR-Array芯片的制备方法，建立了多重巢式固相PCR检测4种高致病性病原微生物的方法。为了验证本方法的特异性，使用制备好的4种阳性样本DNA或RNA为实验样品，并将特异性引物以一定顺序固定在芯片上，如图4所示。只有加入相应核酸样品时，对应位置的引物固定点才有荧光信号，而其它固定点无荧光信号。上述结果表明，本研究建立的多重巢式固相PCR-Array芯片检测4种高致病性病原微生物具有较好的特异性。同时，此芯片通量可以根据筛查范围需要进行扩展，一张芯片可实现数十种甚至上百种病原微生物的检测。当面临突发疫情爆发时，本研究为病原微生物筛查提供了一种新的检测方法。

    通过10倍梯度稀释4种阳性样本DNA或RNA确定多重巢式固相PCR-Array芯片检测4种病原微生物的灵敏度。以埃博拉病毒阳性样品为例，采用10倍梯度稀释方法，制备了5.62×105 copy/μL～5.62 copy/μL的实验样品，在优化条件下，进行巢式固相RT-PCR，检测结果如图5A所示。随着模板浓度的增加，巢式固相PCR-Array芯片各固定点荧光信号增加，表明在较高浓度下，芯片表面发生更多扩增。以相同方法，对其它3种高致病性病原微生物的灵敏度进行测试，通过计算各浓度的荧光信号强度，绘制柱形图，结果如图5B所示，4种高致病性病原微生物的检出限可达10 copy/μL以下。同时，由于固相PCR是通过检测扩增产物的荧光强度实现待测样品的阴阳性判断，属于定性检测，因此，经梯度稀释后的阳性样品，其终产物的荧光强度和初始样品浓度无明显的线性关系。

    4 结 论

    提出了一种多重巢式固相PCR-Array芯片检测高致病性病原微生物的新方法，将微流控芯片与固相PCR技术相结合，引入巢式非对称PCR扩增方法，通过探究多重巢式固相PCR-Array芯片的制備方法和扩增体系，提高了本方法的检测灵敏度及特异性，实现了多种细菌和病毒的并行快速检测，极大地促进了固相PCR扩增在病原微生物检测领域的应用。构建了包含有炭疽杆菌、布鲁氏菌特异性基因序列的DNA重组质粒和包含有新疆出血热病毒和埃博拉病毒特异序列的逆转录病毒颗粒，真实模拟了PCR过程中的逆转录过程，首次建立了用于4种高致病性病原微生物同时检测的多重固巢式固相PCR检测方法，在多种病原微生物高通量并行检测方面具有较好的应用前景。

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    Multiplex Nested Solid Phase PCR-Array Chip for

    Simultaneous Detection of Highly Pathogenic Microorganisms

    ZHU Can-Can1，2， CUI Jun-Sheng1， HU An-Zhong1， YANG Ke1， ZHAO Jun1，2，

    LIU Yong1， DENG Guo-Qing1， ZHU Ling

    1（Institute of Applied Technology， Hefei Institutes of Physical Science， Chinese Academy of Sciences，

    Anhui Provincial Engineering Technology Research Center for Biomedical Optical Instrument，

    Anhui Provincial Engineering Laboratory for Medical Optical Diagnosis & Treatment

    Technology and Instrument， Hefei 230031， China）

    2（University of Science and Technology of China， Hefei 230026， China）

    Abstract To simultaneously detect bacteria and viruses in a single test， a PCR-array chip based on solid phase PCR（SP-PCR） was developed. Ultraviolet cross-linking method was used to fix oligonucleotide sequence on the grass to develop a PCR array chip for detection of Crimea-Congo hemorrhagic fever virus （CCHFV）， Ebola virus， Bacillus anthracis and Brucella multiplex. Owing to the lack of real sample and consideration of biological safety， the vectors of Bacillus anthracis and Brucella were constructed by genetic engineering. Meanwhile， to simulate the reverse transcription process of CCHFV virus and Ebola virus， virus-like particle （VLP） containing two specific viral fragments was constructed by virus packaging technique. The primer fixation efficiency and solid-phase RT-PCR reaction system were optimized with four positive samples. The results showed that the optimum time of cross-linking was 9 min， the optimum concentration was 100 μmol/L， and the minimum detection limit of the multiplex solid-phase RT-PCR was under 10 copy/μL. This method with high sensitivity and specificity avoided mutual interference among the primers by isolation them on space and improved the detection flux. This PCR-Array chip would be widely employed for the rapid parallel detection of bacteria and viruses.

    Keywords Highly pathogenic microorganisms; Multiplex; Nested solid phase PCR-Array chip