胶体金免疫层析试纸法检测农产品中戊唑醇残留

    许俊丽　刘贝贝　王玉龙　李盼　杨康　吴勤　蒋岚　张皓然　杨立飞　张存政

    

    

    

    摘 要 利用纳米金标记高亲和、高特异性戊唑醇单克隆抗体，建立了戊唑醇免疫层析快速检测方法，通过裸眼观察可快速定性判断是否超过最大限量值（MRL），实现了样品现场快速筛查与精准定量分析，具有快速、精准、低成本的优点。以20 nm的胶体金颗粒标记抗戊唑醇单克隆抗体作为检测探针，分别将包被原Teb-OVA（0.3 mg/mL）和羊抗小鼠IgG抗体（1 mg/mL）包被于硝酸纤维膜（NC膜）， 形成检测线（T线）和质控线（C线），组装成的胶体金免疫层析检测试纸条裸眼观察的检出限为6.25 ng/mL（T线完全消线），可在15 min内实现小麦、黄瓜和甘蓝中戊唑醇的定性与半定量分析，分析结果与高效液相色谱质谱联用（LC-MS/MS）方法的检测结果一致。胶体金免疫检测方法特异性和准确性好，操作方便，重复性好，可满足现场快速筛查大量样品的需求。

    关键词 戊唑醇残留; 胶体金免疫层析; 液相色谱串联质谱

    1 引 言

    戊唑醇（Tebuconazole， 1-（4-氯苯基）-3-（1H-1，2，4-三唑-1-基甲基）-4，4-二甲基戊-3-醇）是一种三唑类杀菌剂，能有效防治由白粉菌属、柄锈菌属、喙孢属、核腔菌属和壳针孢属引起的病害，广泛用于小麦、蔬菜、香蕉、苹果等作物的种子处理和叶面防治[1～5]，是三唑类杀菌剂中使用量与销售最高的品种之一[6]，防治谱广，使用广泛。但戊唑醇对哺乳动物具有毒性，且在肝脏和血液中有毒性蓄积作用，具有潜在的非遗传致癌毒性作用及环境激素内分泌干扰效应[7～9]。美国环保署（EPA）已将三唑类杀菌剂中的戊唑醇、烯效唑、己唑醇、丙环唑和氟环唑列入潜在的人类致癌物名单[10]，欧盟委员会和我国规定了部分农作物和蔬菜中戊唑醇的最大残留限量（0.05 mg/kg）[11，12]。因此，研发快速、精准的戊唑醇残留分析方法，是进行有效监管的重要环节。

    戊唑醇残留的仪器检测方法包括气相色谱法（氮磷检测器，GC-NPD）、高效液相色谱法（HPLC）、气相色谱-质谱法（GC-MS）、高效液相色谱-质谱联用（LC-MS/MS）和毛细管气相色谱法等。Dong等[13]采用LC-MS/MS测定戊唑醇及其代谢产物在土壤、葡萄中的残留动态与风险评估，方法的检出限为0.1 mg/kg。 Zhang等[14]建立了HPLC方法对土壤沉积物中的戊唑醇等3种手性三唑类杀菌剂的同分异构体的降解情况进行研究，手性化合物的消长分布符合一级动力学方程，且与沉积物的性质相关联。Wang等[15]建立了固相萃取-超高效液相/串联质谱法检测水中戊唑醇残留，不同基质检出限为0.001～41.27 ng/L，回收率为76%～97%。刘军等[16]采用分散固相萃取-液相色谱-质谱法测定水稻及土壤中戊唑醇残留量，检测范围为5～200 μg/L，检出限为2.5 ×10-11 g。

    免疫分析技术广泛用于现场检测和高通量筛选，具有简单、便携、快速、低成本等优点，是仪器分析方法的补充[17]，包括酶联免疫吸附分析（ELISA）、免疫层析试纸条和免疫传感器等[18～21]。其中以纳米金作为信号输出的胶体金试纸条实用性强， 操作简单， 裸眼即可判定结果，应用广泛。目前，对戊唑醇的免疫分析报道不多，主要是由于不易获得高质量抗体，其中基于胶体金试纸条的残留检测方法未见报道。Danks 等[22]报道了基于多克隆抗体的ELISA方法，对戊唑醇的检测范围为0.02～20 mg/L; Qi等[23]利用分子印迹电化学传感器等方法（ECA），通过信号的放大作用实现对戊唑醇的检测，灵敏度达到3.85 ng/mL; Chen等[24]通过设计半抗原获得特异性抗体，建立的免疫分析方法对水样中的戊唑醇的检测灵敏度为0.197～0.297 ng/mL。本研究以前期设计的新型半抗原制备的抗戊唑醇的高特异性、高亲和力单克隆抗体为材料，建立了半定量胶体金免疫层析试纸条分析方法，实现裸眼观察确定戊唑醇残留，经ELISA鉴定此抗体对戊唑醇的检测灵敏度为0.07 ng/mL（IC20），IC50为 0.19 ng/mL[25]; 同时，建立了基于LC/MS-MS的检测方法，以小麦、黄瓜和甘蓝等样品为对象，进行了方法的验证，表明两种检测方法配合使用可以实现对戊唑醇的精准、快速检测，优势互补。其中，免疫层析试纸快速、方便，能用于现场检测，LC-MS/MS方法准确、灵敏，可用于大量样品的高通量定量检测。

    2 实验部分

    2.1 仪器与试剂

    XYZ3050TM试纸条喷膜仪（Bio-Dot公司）; ZQ2000微电脑试纸条自动切割仪（上海金标生物科技有限公司）; Lambda25 UV-vis Spectrometer双光束紫外-可见分光光度计（美国Perkin Elmer公司）; Agilent Technologies 1260 Infinity高效液相色譜-质谱联用仪（美国Agilent公司）; Multiscan ascent 酶标仪（美国Thermo公司）; H-7650透射电子显微镜（日本日立公司）; 硝酸纤维素膜（NC膜）、金标结合垫、吸水垫（美国Millipore公司）; 聚氯乙烯（PVC）底板、样品垫（上海金标科技生物有限公司）; 超纯水净化仪（美国Labconco公司）。

    戊唑醇标准品（农业部环境质量监督检验测试中心（天津））; 戊唑醇单克隆抗体（Teb McAb）及半抗原、包被原（Teb-OVA）由本实验室制备。羊抗小鼠IgG（武汉博士德生物工程有限公司）; 牛血清蛋白（BSA）、氯金酸（HAuCl4·3H2O）、二水合柠檬酸三钠（C6H5Na3O7·2H2O）（美国Sigma公司）; 其它试剂均为分析纯（西陇化工股份有限公司）。小麦粉产于江苏省农业科学院试验田，甘蓝、黄瓜购于南京某超市。

    2.2 抗原的制备

    2.2.1 半抗原的合成 戊唑醇半抗原的合成如图1所示， 以C5H10COOH基团取代戊唑醇苯环上的p-Cl，引入偶联臂和活性COOH基团，合成半抗原。

    2.2.2 包被原的制备 采用混合酸酐法将合成的戊唑醇半抗原与卵清蛋白OVA（BSA）偶联制备包被原。将0.05 mmol（19.4 mg）半抗原溶于1 mL 二甲基甲酰胺（DMF）中，再依次加入20 μL三正丁胺和10 μL氯甲酸异丁酯，4℃条件下搅拌反应1 h，得到反应混合物; 将0.5 μmol（30 mg）OVA溶于5 mL碳酸盐缓冲溶液中，再逐滴缓慢加入上述混合物，搅拌反应2 h; 将得到的反应物透析，分装后于-20℃保存，备用。

    2.3 胶体金的制备与鉴定

    采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金[26]： 500 mL三角瓶中加入200 mL二次蒸馏水，再加入1 mL 1% HAuCl4混合均匀，置于微波炉中加热5 min至沸腾; 取出三角瓶，迅速顺时针轻轻晃动，快速加入经滤膜过滤的1%柠檬酸三钠水溶液5 mL，快速混匀，放入微波炉中加热4～5 min至沸腾，制备的酒红色液体即为胶体金溶液。室温避光冷却后，用超纯水定容至200 mL，4℃避光保存。紫外分光光度计扫描测定波长400～600 nm的最大吸收峰（λmax=519 nm）。透射电子显微镜（TEM）观察鉴定胶体金颗粒的粒径及分散性，结果显示，胶体金颗粒分散均匀、无聚集，粒径约为20 nm。

    2.4 胶体金标记抗体探针的制备

    2.4.1 最佳标记pH值条件优化 取10个1.5 mL 离心管，分别加入1 mL胶体金溶液，依次编号为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9; 向各离心管中加入与编号数相同体积（μL）的0.1 mol/L K2CO3溶液，迅速充分混匀，调节溶液pH值; 向各离心管中加入20 μL 0.62 mg/mL戊唑醇单克隆抗体，轻轻摇匀，室温下静置反应2 h; 测定未出现沉淀的溶液在400～600 nm的吸收光谱，并以K2CO3溶液加入量为横坐标、各溶液最大吸收值为纵坐标，选取吸收值最大时对应的K2CO3加入量，确定最佳标记pH值条件。

    2.4.2 抗体最佳标记量的优化 取12个1.5 mL的离心管，分别加入1 mL胶体金溶液，再以7 μL 0.1 mol/L K2CO3调至溶液pH值（如2.3.1节）; 依次加入戊唑醇单克隆抗体，使溶液终浓度为0、0.62、1.24、1.86、2.48、3.1、3.72、4.34、4.96、5.58、6.20和6.82 μg/mL，混匀后，室温静置5 min; 每管分别加入10%（m/V）NaCl溶液100 μL，静置5 min，观察记录溶液的颜色变化，判断抗体的最适标记量。

    2.4.3 胶体金标记抗体探针 取5 mL胶体金溶液，加入35 μL 0.1 mol/L K2CO3调节溶液pH值，加入8 μL抗体（0.62 mg/mL），室温下搅拌反应30 min; 加入10% （m/V） BSA溶液至BSA终浓度为0.01 g/mL， 室温下继续搅拌反应30 min，12000 r/min离心35 min，弃上清液，加入0.5 mL重悬液（0.01%硼酸， 0.2% PEG 20000，0.02% NaN3）重悬沉淀，即得到胶体金标记戊唑醇单克隆抗体探针溶液，4℃避光保存，备用。

    2.5 胶体金免疫试层析纸条的组装与结果判定

    2.5.1 试纸条的组装 完整的试纸条包括聚氯乙烯（PVC）底板、吸水垫、NC膜、金标垫和样品垫（图2）。将NC膜贴在PVC底板的中间，用喷膜仪在NC膜上分别喷涂戊唑醇包被原（Teb-OVA）和羊抗鼠抗体（IgG），作为检测线（T）和质控线（C），T线和C线间隔4 mm; 金标结合垫和吸水垫于NC膜两端重合1～2 mm贴在PVC底板上，金标结合垫贴在近检测线（T）端，吸水垫近质控线（C）端; 样品垫与金标结合垫重合1～2 mm贴在PVC底板上，组装完毕的PVC底板用切条仪切割成3.5 mm×60.0 mm试纸条。 37℃干燥箱干燥2 h，密封保存。

    2.5.2 试纸条检测结果的判定 将1 μL胶体金免疫探针固定于胶体金垫，干燥保存，待用，使用时，向样品垫中滴加75 μL待测样品液或不同浓度的戊唑醇标准品溶液（5%甲醇-PBS緩冲液稀释配制），15 min后裸眼观察判定检测结果，结果如图3所示。（1）当待测液中不含戊唑醇或浓度极低， 不足以检出时，金标抗体与固定于T线上的包被原结合，形成肉眼可见的红色条带，同时，过量的金标抗体与C线上固定的羊抗鼠IgG抗体结合，形成肉眼可见的红色条带，此时T线与C线均为红色条带，当T线显色等同或深于C线时，结果判定为阴性; （2）当待测液中存在戊唑醇（可检出，浓度<6.25 ng/mL），或浓度高于6.25 ng/mL时，戊唑醇与金标抗体结合， T线颜色变浅或不显色，免疫复合物或者多余的金标抗体与C线二抗结合显红色，此时T线颜色变淡（浅于C线颜色）或无色（戊唑醇浓度≥6.25 ng/mL），结果判断为阳性; （3）当C线不显色时，无论T线是否显色，均判为试纸条失效。

    2.6 戊唑醇LC-MS/MS检测方法的建立

    2.6.1 仪器检测条件 （1）液相色谱条件 ZORBAX SB-C18色谱柱（150 mm × 2.1 mm， 3.5 μm）; 流动相为乙腈-0.1%甲酸溶液（9∶1， V/V）; 流速： 0.4 mL/min; 进样体积为5 μL; 柱温40℃。（2）质谱条件 多反应监测（MRM）模式扫描; 电喷雾正离子源（ESI+）; 离子化电压：4000 V; 雾化气温度为350℃; 喷雾气压力为25 psi，流速为10 L/min。详细质谱检测参数见表1。

    2.6.2 标准品溶液配制及标准曲线 称取标准品，用乙腈溶液配制成浓度为100 mg/mL的标准储备溶液。使用时用乙腈逐级稀释成浓度为0、2.5、5、10、20、50、100和200 ng/mL的标准溶液。以定量子离子峰面积为纵坐标（y），浓度为横坐标（x），建立LC-MS/MS检测标准曲线。

    2.7 样品处理

    2.7.1 样品提取溶剂的选择 将小麦研磨成粉，黄瓜、甘蓝用食品粉碎机打碎至泥浆状，然后取5 g

    样品于50 mL离心管中，添加戊唑醇农药标准品溶液，添加浓度分别为0、0.02、0.05和0.10 mg/kg。分别加入10 mL 5%甲醇-PBS、甲醇、乙腈和丙酮，除5%甲醇-PBS提取液，其它提取溶液中加入3 g NaCl，振荡提取30 min， 5000 r/min离心5 min。

    2.7.2 样品提取液净化 准确吸取5 mL上层提取液于10 mL离心管中，氮气吹干。准确加入2 mL乙腈复溶，小麦样品再加入1.0 mg C18，涡旋振荡3 min，用0.22 μm滤膜过滤，通过仪器（LC-MS/MS）检测戊唑醇，比较各提取溶剂的提取效率。

    2.7.3 样品基质影响 选择提取效率最高的溶剂进行添加回收实验。在小麦、黄瓜、甘蓝样品中添加戊唑醇，浓度分别为0、0.02、0.05和0.10 mg/kg，每组重复3次，提取后，以氮气吹干，用5%甲醇-PBS复溶，进行试纸条测试，并与LC-MS/MS结果进行对比。

    3 结果与分析

    3.1 戊唑醇半抗原的鉴定

    戊唑醇半抗原分子式： C22H33N3O3，相对分子质量为387.25，质谱检测得到m/z 388.3 [M+H]，符合预期分子量，1H NMR （DMSO）结果表明羧基偶联改造成功： δ 11.98 （s， 1H， COOH）， 8.51 （s， 1H， Ar-H）， 8.01 （s， 1H， Ar-H）， 6.99～7.06 （m， 4H， pH-H）， 4.52 （s， 1H， CH2）， 4.25～4.39 （m， 2H， CH2）， 2.47～2.54 （m， 2H， CH2）， 2.17～2.20 （t， 2H， CH2）， 1.89～1.90 （m， 1H， CH2）， 1.73～1.76 （m， 1H， CH2）， 1.62～1.64 （m， 1H， CH2）， 1.51～1.60 （s， 4H， 2CH2）， 1.31～1.47 （m， 2H， CH2）， 1.29 （s， 9H， 3CH3）。

    3.2 免疫原和包被原的鉴定

    采用紫外分光光度法（240～400 nm）扫描戊唑醇半抗原、载体蛋白BSA、OVA及偶联物免疫原、包被原，结果表明，免疫原（半抗原-BSA）和包被原（半抗原-OVA）有明显的吸收峰偏移，表明偶联成功。计算免疫原和包被原的摩尔比分别为24和33。

    3.3 金标抗体制備条件的优化

    3.3.1 最佳标记pH值 将戊唑醇单克隆抗体加入到以0.1 mol/L K2CO3溶液调节的不同pH值的胶体金溶液中，测定其吸收值。结果表明，当1 mL胶体金溶液加入7 μL 0.1 mol/L K2CO3，溶液的吸收值最大，最大吸收峰为521 nm，最大吸收值为0.644，此时胶体金颗粒表面结合的抗体最多，为胶体金颗粒与抗体结合的最佳标记pH条件。

    3.3.2 抗体最适标记浓度 柠檬酸根保护的胶体金颗粒外层带有负电荷，在静电作用下，胶体金溶液为稳定的胶体状，在加入10% （m/V）NaCl时，由于盐离子的作用，胶体金溶液发生聚沉，由均一的酒红色变为蓝色。抗体蛋白可通过物理吸附（静电作用、疏水力及AuS键）与柠檬酸根包裹的胶体金结合，增加分子间距，在较高浓度盐离子下，使胶体金颗粒仍能保持良好的分散性。盐析诱导沉聚实验表明，当抗体标记浓度≥4.96 μg/mL时，在盐析作用下，胶体金标记的抗体仍保持稳定，溶液颜色与原胶体金溶液颜色一致，即戊唑醇单克隆抗体最小标记浓度为4.96 μg/mL。

    3.4 试纸条检测线与质控线的优化

    优化了硝酸纤维素膜上C线（羊抗小鼠IgG抗体）和T线（戊唑醇包被原）的喷涂浓度。当C线喷涂1 mg/mL羊抗小鼠IgG，喷涂量为0.6 μL/cm时，C线显示清晰的红色条带。采用棋盘法优化T线戊唑醇包被原浓度，得最优C线羊抗小鼠IgG浓度为1 mg/mL，喷涂量为0.6 μL/cm; 最优T线戊唑醇包被原（Teb-OVA）浓度为0.3 mg/mL，喷涂量为0.6 μL/cm。

    3.5 试纸条的灵敏度和特异性

    以5% 甲醇-PBS溶液配制系列浓度的戊唑醇标准品溶液，使最终浓度为0、1.50、3.15、6.25、12.5、25.0和50.0 ng/mL。分别取75 μL样液用于试纸条检测，T线完全消失时的戊唑醇浓度即为试纸条的检出限。如图4所示，随着戊唑醇浓度升高，T线颜色逐渐变浅，当戊唑醇浓度为6.25 ng/mL时，T线颜色基本完全消失，即为胶体金试纸条的检出限（6.25 ng/mL， 参照前述样品前处理稀释10 ×， 换算后浓度为0.05 mg/kg），满足国家标准中对小麦、蔬菜中农药最大残留限量检测的要求（0.05～1.0 mg/kg， GB2763-2016）[11]。

    以5% 甲醇-PBS溶液分别稀释多效唑、腈菌唑、丙环唑和己唑醇标准品至终浓度为1.0 μg/mL，用试纸条检测，观察试纸条的交叉反应情况。结果表明，只有戊唑醇出现明显的抑制，T线消失（图5），表明此试纸条对戊唑醇有较好的特异性。

    3.6 样品提取条件的优化

    3.6.1 提取溶剂的选择 样品添加浓度分别为0、0.02、0.05和0.10 mg/kg，考察乙腈、丙酮、甲醇和5%甲醇-PBS 4种溶剂对戊唑醇的提取效率。 如表2所示， 提取效果为乙腈>丙酮>甲醇>5%甲醇-PBS，因此， 选取乙腈为添加回收实验的提取溶剂，效率为79.0%～95.5%。

    3.6.2 样品提取液的净化 以乙腈为提取溶剂进行样品前处理及净化，由图6可见，本研究的净化方法对小麦、黄瓜和甘蓝3种基质的净化效果均较好，样品峰不受到其它杂质因素的影响，满足戊唑醇在农作物样品中的残留分析要求。

    3.6.3 样品基质对胶体金试纸条的影响 取5 g小麦、黄瓜、甘蓝样品，加入10 mL乙腈，按2.8节方法操作，取5 mL上清液，经氮气吹干后，加入2.0 mL 5%甲醇-PBS复溶，过滤，得到小麦、黄瓜、甘蓝的基质混合溶液。将其分别稀释2、5、10、20倍，得到相应稀释液，用稀释液配制成浓度为0、 3.13和6.25 ng/mL的戊唑醇基质标准溶液，并与5%甲醇-PBS配制的空白溶液比较。由表3可知，小麦样品稀释倍数5时，与空白结果一致。黄瓜和甘蓝样品则在稀释10倍之后与空白结果一致，表明可通过稀释样品提取液消除基质干扰作用。本实验中3种样品均选择稀释10倍液检测，以消除基质对胶体金免疫层析试纸的影响。

    3.7 方法验证

    3.7.1 戊唑醇LC-MS/MS方法验证 选取小麦、黄瓜和甘蓝样品进行添加回收实验，TEB添加浓度为0.02、0.05和0.10 mg/kg。样品经乙腈提取、净化后，用于LC-MS/MS检测。如表4所示，平均回收率为75.0%～100.0%，方法的检出限（LOD）为1.5 ng/mL，相对标准偏差（RSD）小于6.9%，表明建立的戊唑醇LC-MS/MS检测方法准确，可用于黄瓜、甘蓝样品中戊唑醇的测定，与文献[27]报道结果一致。

    3.7.2 免疫层析方法验证 小麦、黄瓜、甘蓝样品中戊唑醇添加浓度分别为0、0.02、0.05和0.10 mg/kg， 静置2 h。样品提取过程如前述，基于抗体及NC膜对有机试剂的耐受程度及简化前处理方法、基质干扰（假阳性、假阴性）的考虑，以5%甲醇-PBS稀释10倍直接用于试纸条检测。检测结果如图7所示，小麦、黄瓜、甘蓝的基质在稀释10倍后对试纸条均无影响，裸眼检测灵敏度为6.25 ng/mL（结合前述样品前处理过程，换算结果为0.05 mg/kg）， 表明添加浓度≥0.05 mg/kg时，样品经乙腈提取，5%甲醇-PBS复溶并稀释10倍后，检测结果为阳性。

    4 结 论

    建立了快速准确检测小麦、蔬菜样品中戊唑醇残留的胶体金免疫层析试纸条检测方法，并采用高效液相色谱-质谱联用法（LC-MS/MS）对戊唑醇进行定量分析。所建立的试纸条对戊唑醇的裸眼观察检测灵敏度为6.25 ng/mL（结合样品前处理过程，换算后为0.05 mg/kg），满足国家标准中对小麦、蔬菜中农药最大残留限量检测的要求（0.05～1.00 mg/kg，GB2763-2016）。此试纸条特异性高，对其它三唑类杀菌剂丙环唑、腈菌唑、多效唑、己唑醇无交叉反应，LC-MS/MS方法的检出限为1.0 ng/mL。两种方法配合使用，可实现对小麦、黄瓜和甘蓝样品中戊唑醇的残留的快速、准确、定量分析。

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    Lateral Flow Assay for Determination of Tebuconazole

    in Agricultural Products

    XU Jun-Li1，2， LIU Bei-Bei2， WANG Yu-Long2， LI Pan2， YANG Kang2， WU Qin2，

    JIANG Lan2，? ZHANG Hao-Ran2， YANG Li-Fei1， ZHANG Cun-Zheng2，3

    1（College of Horticulture， Nanjing Agricultural University， Nanjing 210095， China）

    2（Institute of Food Safety and Nutrition， Jiangsu Academy of Agricultural Sciences， Nanjing 210014， China）

    3（School of Food and Biological Engineering， Jiangsu University， Zhenjiang 212013， China）

    Abstract A Lateral flow assay was developed for the rapid determination of Tebuconazole residues in wheat and vegetables based on the high affinity and specific anti-Tebuconazole monoclonal antibody. For the lateral flow assay development， firstly， 20 nm size colloidal gold nanoparticle was synthesized to label anti-Tebuconazole monoclonal antibody （Mab） as a detection agent. Teb-OVA （0.3 mg/mL） conjugate and goat anti-mouse IgG antibody （1 mg/mL） were coated on nitric acid fiber membrane （NC） to form the test line （T） and quality control line （C）， respectively. Under the optimized conditions， the assembled immunochromatographic strip could accomplish the detection of Tebuconazole within 15 min. The Limit of detection observed by naked eyes was 6.25 ng/mL， with negligible cross-reactivity to the analogs of Tebuconazole. Meanwhile， for comparison， a high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry （LC-MS/MS） method was established to determine Tebuconazole accurately and quantitatively. The results released that these two developed methods matched each other very well. These two methods could be successfully employed for the detection of Tebuconazole in wheat， cucumber， and cabbage， high-throughput， specific and precise. Immunochromatographic strip could contribute to on-site determination， and LC-MS/MS based method provided accurate quantification.

    Keywords Tebuconazole residue; Immunochromatographic strip; High performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry