基于硫同位素稀释质谱法的β淀粉样多肽绝对定量研究

    霍中中 冯流星 李红梅 熊金平

    

    

    

    摘?要?采用液相色谱-同位素稀释质谱（HPLC-ID-ICPMS）在线联用技术，通过对β淀粉样多肽中硫元素的测定，实现了β淀粉样多肽的准确定量分析。首先通过优化4种液相色谱条件，将β淀粉样多肽纯品中的Aβ42与杂质进行分离，然后将液相洗脱液与34S稀释剂在线混合，针对34S稀释剂对34S/32S信号强度和灵敏度的影响，对34S稀释剂的流速进行了优化，并根据同位素稀释法的公式以及Aβ42中硫元素含量，得到β淀粉样多肽中Aβ42的含量为（0.763±0.004） g/g。本方法在5～60 μg/g范圍内，线性相关系数为0.999，检出限为140 pg/g，定量限为467 pg/g，目标物的回收率均在98%～105% 之间，相对标准偏差均小于6%。本样品采用氨基酸水解法的测量结果为（0.768±0.009） g/g，两种方法的测量结果一致性良好。

    关键词?β淀粉样多肽; 硫元素; 绝对定量; 同位素稀释法

    1?引 言

    阿尔兹海默症（Alzheimer's disease，AD）是不可逆的神经退行性疾病，随着人口的老龄化，AD的发病率越来越高，AD病的致病机理和临床治疗也引起了广泛关注[1～3]。 临床研究表明，血液、脑脊液和脑组织内的β淀粉样多肽（β amyloid peptide，Aβ42）水平异常与AD的进程密切相关，Aβ42已成为目前研究AD的重要生物标志物之一[4]。因此，建立绝对定量分析Aβ42的方法对AD的早期诊断及药物研发有重要意义。

    Aβ42由42个氨基酸组成，由淀粉样前体蛋白经β-分泌酶和γ-分泌酶水解产生，Aβ42约占水解产物的10% [5]。目前，文献中报道的临床检验中针对Aβ42的定量方法有酶联免疫法[6]、电化学方法[7]、磁珠标记结合电子发射断层显像法[8]、毛细管电泳法[9]等。但这些方法都是相对测量法，不同方法之间的检测结果差异较大。Aβ42纯品标准物质位于溯源链的顶端，是基体标准物质的溯源源头。溯源性是指通过一条具有规定不确定度的不间断的比较链，使测量结果或测量标准的值，能够与规定的参考标准通常是国家标准或国际标准联系起来的特性，计量学溯源性的理想终点是国际单位制系统（SI）。因此，亟需建立具有高准确度、高精密度、可溯源到SI单位的纯品Aβ42绝对定量参考测量方法。

    纯品蛋白质的定量方法主要分为两类：氨基酸水解法（Amino acid hydrlysis analysis，AAA）和肽段酶解法[10]。氨基酸水解法中选择待测蛋白水解后的2种以上氨基酸，通过定量测定氨基酸实现纯品蛋白质的定量分析，但是，杂质肽段水解后的氨基酸可能对定量分析有影响。肽段酶解法定量分析是通过定量分析酶切后特异性肽段实现纯品蛋白的定量分析，该方法可避免杂质肽段水解的氨基酸对实验结果的影响，但酶解法需要合成同位素标记的目标肽段，并进行浓度认证，该过程会使最后定量分析结果的不确定度增大。

    电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）法灵敏度高，检测范围广，样品处理简单，易与色谱联用。另外，ICP-MS可同时测定一种元素的不同同位素的能力使其应用于蛋白质组学的绝对定量分析成为可能[11]。根据Swiss Prot蛋白质数据库的统计分析，分别有96.6%和98.8%的蛋白质含有半胱氨酸、甲硫氨酸等含硫氨基酸[12]。如蛋白质的氨基酸序列已知，则可通过定量分析硫含量实现蛋白的定量分析[13]。同位素稀释法（ID）是国际公认的化学计量方法，在样品处理前，向待测溶液中加入同位素丰度已知的稀释剂溶液，通过直接测定目标元素在待测混合物中的同位素比值变化[14]，可实现待测元素的定量分析[15～17]。与传统的定量分析方法相比，同位素稀释法可避免样品处理中的损失对实验结果造成的影响[18]，其测量结果更加准确可靠，且可直接溯源到SI单位[19]，因此在标准物质定值及国际比对中应用广泛。基于HPLC-ID-ICPMS定量分析蛋白有许多优点[20]。在测定Aβ42中硫元素含量时，采用柱后在线连续添加已知的浓度34S同位素稀释剂，通过在线连续监测32S/34S的信号强度随时间变化，积分同位素信号强度与时间坐标轴形成的峰面积，结合同位素稀释方程，可直接计算硫元素的含量[21]，进一步结合蛋白质的分子量及所含硫元素的含量，最终实现蛋白质的绝对定量分析。鉴于ICP电离几乎与物种无关的性质，并且通常在色谱分离后加入标准品，因此，实验过程中无需匹配与待测样品类型相同（标记的或非标记的）的标准物质[22]。

    本研究采用硫元素同位素稀释法定量分析β淀粉样多肽中Aβ42含量。通过优化4种液相色谱条件，最终确定20 mmol/L NaH2PO4-Na2HPO4（64∶36，V/V）为流动相时分离效果最好。在此条件下，将β淀粉样多肽纯品中的Aβ42与杂质分离，34S稀释剂与液相洗脱液在线混合，基于34S稀释剂对34S/32S信号强度和灵敏度的影响对34S稀释剂的流速进行了优化，根据同位素稀释法的公式以及Aβ42中硫元素的含量，得到β淀粉样多肽中Aβ42的含量，本方法测量结果与氨基酸定量分析结果一致。

    2?实验部分

    2.1?仪器与试剂

    Element Ⅱ型扇形磁场电感耦合等离子体质谱仪（美国Thermo Fisher Scientific公司）; 高效液相色谱系统（日本Shimadzu公司），配 LC-30AD 泵、LC-20AD 泵、SIL-30AC 自动进样器、CTO-20A 柱温箱和SPD-20A 紫外检测器; 6410QQQ液相色谱-质谱联用仪（美国 Agilent公司）; Toledo 型电子天平（瑞士Mettler公司）; Mill-Q 超纯水系统（美国 Millipore公司）。

    β淀粉样多肽（95%，上海吉尔生化公司）; 34S 浓缩同位素（美国橡树岭实验室）; 丙氨酸（99.4%，GBW（E）100054）、缬氨酸（99.4%，GBW（E）100055）、苯丙氨酸（99.9%，GBW（E）100061）和水中硫酸盐硫含量及同位素（32S、33S和34S）溶液标准物质（GBW（E）082519）来自中国计量科学研究院; 标记丙氨酸（13C3，99%; 15N，99%）、标记缬氨酸（13C5，98%; 15N，98%）、标记苯丙氨酸（13C9，99%; 15N，99%）来自美国剑桥同位素实验室（CIL）; 甲酸、乙腈、甲酸铵、乙酸铵、NaH2PO4、Na2HPO4（美国Fisher Scientific 公司）; HCl为国产优级纯试剂; 实验用水为超纯水（18.2 MΩ·cm）。

    2.2?同位素稀释剂、标准混合溶液及待测样品溶液

    两种同位素稀释剂： 34S稀释剂和标记氨基酸稀释剂，其中34S稀释剂浓度为328.81 μg/g，同位素32S/34S 丰度比为0.01417; 标记氨基酸稀释剂为标记丙氨酸（L-Ala，0.078 μg/g）、标记缬氨酸（L-Val，浓度0.150 μg/g）、标记苯丙氨酸（L-Phe，0.110 μg/g）混合溶液。

    标准混合溶液：浓度为100 μg/g的32S 與34S混合溶液（同位素丰度比1∶1）; 氨基酸储备液： 1 mg/g的丙氨酸（Ala）、缬氨酸（Val）、苯丙氨酸（Phe）溶液。

    待测样品溶液：取1 mg/g β淀粉样多肽溶液，用超纯水稀释至0.1 和0.001 mg/g，用于硫元素定量分析实验。

    2.3?样品前处理

    称取上述0.001 mg/g β淀粉样多肽溶液约1.0000 g，加入标记氨基酸稀释剂约1.0000 g，其中稀释剂的加入量与目标多肽水解后的选定的氨基酸质量比为1∶1，真空干燥，去除溶剂。然后加入0.5 mL 6 mol/L HCl，混合均匀后，通氮除氧，密封处理。将上述溶液在 110℃烘箱中水解，每隔 6 h涡旋混匀1次。水解24 h后取出，氮气吹干，用含有0.1% HCl溶液复溶，溶液经0.22 μm滤膜过滤后，用于氨基酸定量分析实验。

    2.4?硫元素定量分析实验

    2.4.1?色谱条件?色谱柱：TSK-gel G3000SWxl （7.8 mm×300 mm）; 柱温30℃; 进样体积10 μL; 流速0.5 mL/min; 流动相：20 mmol NaH2PO4-Na2HPO4（64∶36，V/V）等度洗脱; 紫外检测器波长220 nm。

    2.4.2?质谱条件?仪器工作参数为：功率1300 W，样品气流速1.05 L/min，辅助气流速0.87 L/min，冷却气流速16.0 L/min，分辨率（m/Δm） 4000，扫描次数 700 × 1。

    2.4.3?硫元素测定?采用硫元素同位素稀释法测定Aβ42中硫元素含量时，先用S标准溶液校准34S稀释剂浓度，实验获得的溶液中32S/34S同位素比，带入公式（1）[23]即可得到校准后34S稀释剂浓度。

    式中，Rz、Ry和Rb分别表示待测样品、稀释剂和混合后样品中被选定的两个同位素的丰度比; Riy和Riz分别表示稀释剂和待测样品中第i个同位素与参考同位素的同位素丰度比; n是最大同位素的序号; my和mz 分别为混合时稀释剂、待测样品的质量; cy和cz 分别为稀释剂、待测样品的浓度; Mi为第i个同位素的相对原子质量。

    测Aβ42中硫的含量时，通过岛津液相系统自带的 LC-20AD 泵加入34S稀释剂，液相色谱的洗脱液与在线添加的34S稀释剂经过三通混合后进入 ICP-MS，在线检测混合溶液中32S/34S同位素比。结合Aβ42的氨基酸序列，一分子Aβ42中有一个S原子，用公式（2）将32S/34S同位素比转换成质量流速，通过式（3）积分得到每个色谱峰对应的S元素的质量。

    式中，Rs、Rsp和Rm分别表示待测样品、稀释剂和混合后样品中32S/34S的丰度比; csp、dsp和 fsp分别代表同位素稀释剂的浓度（μg/g）、密度（g/mL） 和流速（mL/min）; Abs和Absp分别表示样品和稀释剂中核素34S的丰度; Ms和Msp分别表示样品和稀释剂的相对原子质量，MFS表示S质量流速，mS表示每个色谱峰对应的S的质量。

    2.5?氨基酸定量分析实验

    2.5.1?色谱条件?色谱柱： KINETEX C18 （100 mm× 2.1 mm，1.7 μm），柱温20℃;?进样体积10 μL; 流速0.2 mL/min;?流动相： A为0.1%甲酸溶液，B为0.1% 甲酸-乙腈溶液，等度洗脱（VA∶VB=9∶1）。

    2.5.2?质谱条件?多反应监测模式（MRM）; 监测离子对：m/z 90/44.1（Ala），m/z 94/47.1（L-Ala），m/z 117.1/72.1（Val），m/z 124.0/77.1（L-Val），m/z 166.0/120.3（Phe），m/z 176.0/129.3（L-Phe）。

    2.5.3?氨基酸测定?氨基酸水解法测定β淀粉样多肽纯度实验中，根据上述的色谱和质谱条件，将水解后的Aβ42与已知浓度的标记氨基酸稀释剂的混合溶液的MRM模式进行检测。其中，目标氨基酸选择易水解且水解后相对稳定的3种氨基酸（丙氨酸（Ala）、缬氨酸（Val）、苯丙氨酸（Phe））。实验获得的标记氨基酸与天然氨基酸峰面积比，通过式（4）得到质谱峰面积与混合溶液中氨基酸质量的关系，计算得到Aβ42中3种氨基酸质量，再依据式（5）中各氨基酸与Aβ42物质的量的关系，得到β淀粉样多肽中Aβ42的浓度。

    其中，IL和IN是标记氨基酸和未标记氨基酸峰面积; Ix是Aβ42水解的的氨基酸峰面积; mN和mL是未标记氨基酸和标记氨基酸的质量; mx是Aβ42水解的氨基酸的质量; s和c分别表示待测多肽和校准样品; MAA和M分别为氨基酸和Aβ42的相对分子质量; n是Aβ42中相应氨基酸的个数;?m是β淀粉样多肽质量; C是β淀粉样多肽中Aβ42的浓度（g/g），取3种氨基酸（Ala、Val和Phe）计算的平均值。

    3?结果与讨论

    3.1?硫元素定量分析结果

    3.1.1?HPLC-ID-ICPMS定量Aβ42中硫含量?为了分离出β淀粉样多肽中Aβ42，选用甲酸铵（A）、乙酸铵（B）、Na2HPO4（C）、NaH2PO4（D）溶液做流动相，液相色谱-UV在220?nm处检测吸收强度，结果如图1所示，甲酸铵（A）和NaH2PO4（D）将主峰前的杂质洗脱;乙酸铵（B）中杂质和Aβ42未分离;Na2HPO4（C）较乙酸铵（B）洗脱效果较好。根据Aβ42的等电点pI=5.3，酸性可能引起聚集效应，碱性可能破坏Aβ42的结构。因此，进一步优化Na2HPO4和NaH2PO4两者的比例，最后确定流动相的组成为20 mmol/L NaH2PO4-Na2HPO4（64∶36，V/V，pH 6.8），在此流动相下的液相色谱图如图1E所示。需要注意的是，为保证稀释剂和液相洗脱液均匀混合，需在液相色谱进样前，使质谱中32S和34S信号保持稳定。

    通过空白样品中32S的信号确定在线添加34S的浓度为3 μg/g。图2显示了HPLC流动相中34S

    的流速对34S/32S的比值和34S灵敏度的影响，稀释剂为3 μg/g时，改变34S的流速，灵敏度基本不变，34S/32S的比值在0.6 mL/min时最大，之后继续增大稀释剂流速，34S/32S的信号强度减弱，流速过大时，质谱雾化器的雾化效率过低，并且稀释剂和流动相混合不均匀，导致34S信号减弱。因此，34S的最佳流速为0.6 mL/min。

    如图1E所示，Aβ42和杂质在15 min内成功分离，在220 nm处检测吸收强度，34S 同位素稀释剂与液相洗脱液经三通混合后，进入 ICP-MS，在线检测32S/34S信号强度，谱图如图3所示。根据同位素稀释法公式（2），将同位素比值谱图转化为硫元素的质量流谱图，根据公式（3）对Aβ42主峰积分，得到多肽中硫元素的含量为5412.022 μg/g，结合Aβ42所含硫原子数及进样体积，计算出其中Aβ42为（0.763±0.004） g/g。

    3.1.2?线性范围、检出限和定量限?在5～60 μg/g浓度范围内，硫元素含量（y，单位μg）与β淀粉样多肽溶液浓度（x，单位g/g）呈线性关系，线性回归方程为y=5417x-5，相关系数为0.999。因此，采用本方法可实现β淀粉样多肽的高精度检测。另外，截距的95%CI（0.069～0.087）包括零，表明可基于单点校准方法进行量化分析。为保证多肽在色谱柱的洗脱效果，并避免高浓度的多肽溶液造成雾化器堵塞，本方法适用浓度不宜过大，多肽溶液最佳浓度范围为1～100 μg/g。测定空白样品基质基线噪声，以3倍噪声峰高对应的浓度为检出限，以10倍噪聲峰高对应的浓度为定量限，据此计算硫元素定量分析方法的检出限为140 pg/g，定量限为467 pg/g。

    3.1.3?精密度?为了保证该方法的重复性，如表1所示，通过日内精密度（n=6），日间精密度（n=6）和不同浓度水平（n=6），并结合C检验评估本方法的精密度。其中，不同浓度水平考察实验以日内和日间精密度实验样品量为100%，分别考察80%和120%浓度水平对本方法的影响。C检验（95%置信水平）结果表明，天数和浓度之间的差异是均匀的，且对本方法没有影响。此外，实验中所有的C值都未超过临界值C（α，m，f），表明本方法的精密度较高。

    3.2?方法验证

    3.2.1?氨基酸水解法定量分析结果实验结果表明，3个氨基酸完全分离且响应强度较高，MRM模式下3种氨基酸标准混合溶液的质谱图见图4A。3种氨基酸均在10 min内洗脱，不会对下一个样品测定产生干扰。实验过程中待测样品的注射浓度为0.001 mg/g，仪器对此浓度响应良好。按照标准混合溶液、待测样品的顺序测定，通过标准混合溶液计算Aβ42纯度，所述标准混合溶液由经认证的氨基酸标准物质和等量标记的氨基酸组成，待测样品由Aβ42水解的天然氨基酸与同位素标记的氨基酸组成。

    如图4B所示，3种氨基酸的定量分析结果分别为（0.743+0.011） g/g、（0.773+0.013） g/g、（0.751+0.019） g/g，定量分析结果的RSD<5%。取3种氨基酸定量分析结果的平均值，得到氨基酸水解法的测量结果为（0.768±0.009） g/g。氨基酸的水解效率对定量分析结果有一定的影响[24]，水解时间相同的情况下，不同氨基酸水解效率不同，实验的水解条件为强酸环境，丙氨酸耐酸性差[25]，造成结果偏低。因缬氨酸的定量分析结果略大，推测杂质肽段中可能含有缬氨酸。

    3.2.2?两种定量分析结果对比?如图5所示，硫元素定量分析方法的分析结果为（0.763±0.004） g/g，与氨基酸水解法（0.768±0.009） g/g一致，且均低于商品给定的液相色谱纯度95%。由图5可知，硫元素定量分析结果略低于氨基酸水解法，造成此现象的原因是目标氨基酸不仅限于Aβ42中，杂质肽段也可能含有目标氨基酸，这也是传统氨基酸水解法的局限性[26]。另外，采用硫元素定量分析方法的不确定度更小，氨基酸水解法的定量分析结果通常取选定氨基酸的平均值，然而，应该注意的是，尽管采用针对Aβ42的最佳水解条件，但3种氨基酸的定量分析结果依然会存在偏差，综合杂质肽段相应氨基酸引入的误差[27]，所以后者的不确定度更大，且测量结果偏高。

    硫元素定量分析β淀粉样多肽实验，比氨基酸水解或肽段法定量分析纯品蛋白有一定的优势。一方面，对于氨基酸水解法，弥补了杂质肽段水解后对定量分析的氨基酸影响[28]，对肽段定量分析法，弥补了酶切条件优化困难、寻找目标肽段复杂、目标肽段合成和浓度认证存在误差的不足; 另一方面，基于硫元素的分析方法比肽段法更直接追溯到SI单位。前者能够通过多肽中的硫含量溯源至SI，而后者中用作定量分析的肽段首先需进行合成和浓度表征。硫元素标准物质比实验中表征的肽段的不确定度更小，因此，基于硫元素的分析方法可使不确定度最小化。

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