IL-6/STAT3信号通路在百草枯中毒急性肺损伤中作用机制的研究

    李激文 钟雨 刘华 蔡能斌 黄俊杰 韦雪花 邓旺生 黎宇

    

    

    

    【摘要】 目的 探討IL-6/STAT3信号通路在百草枯中毒急性肺损伤中的作用。

    方法 选取72例百草枯中毒患者，根据Murray肺损伤评分分为无肺损伤组、轻微-中度肺损伤组、重度肺损伤组，每组24例，同时收集22名健康者作为对照。支气管肺泡灌洗、AM分离及培养后，ELISA检测血清IL-6、sIL-6R、sgp130的蛋白表达，Westernblot检测STAT3、pSTAT3、gp130的蛋白表达，RT-PCR分析STAT3、gp130mRNA表达。

    结果 轻微-中度肺损伤组、重度肺损伤组IL-6、sIL-6R、sgp130、STAT3、pSTAT3、gp130的蛋白表达明显高于无肺损伤组、对照组（P<0.05），且重度肺损伤组IL-6、sIL-6R、sgp130、STAT3、pSTAT3、gp130蛋白表达水平明显高于轻微-中度肺损伤组（P<0.05）;重度肺损伤组STAT3mRNA、gp130mRNA表达高于其他三组（P<0.05）。

    结论 百草枯中毒肺损伤患者中IL-6/STAT3信号通路通过上调sgp130、gp130蛋白的表达，升高炎症反应程度，对肺组织造成损伤。

    【关键词】 百草枯;急性肺损伤;肺泡灌洗;白介素-6;信号传导与转录激活因子3

    中图分类号：R595.4?? 文献标志码：A?? DOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2021.03.003

    Study on the mechanism of IL-6/STAT3 signaling pathway in acute lung injury induced by paraquat poisoning

    LI Jiwen， ZHONG Yu， LIU Hua， CAI Nengbin， HUANG Junjie， WEI Xuehua， DENG Wangsheng， LI Yu

    （Emergency Department， Liuzhou Workers' Hospital， Liuzhou 545005， Guangxi， China）

    【Abstract】 Objective To investigate the role of IL-6/STAT3 signaling pathway in acute lung injury induced by paraquat poisoning.

    Methods 72 patients with paraquat poisoning were selected， and they were divided into three groups according to Murray lung injury score： non lung injury group， mild to moderate lung injury group and severe lung injury group， with 24 cases in each group， and other 22 healthy people in the same period were selected as control group. Then， after bronchoalveolar lavage， AM isolation and culture， the protein expressions of serum IL-6， sIL-6R and sgp130 were detected by ELISA， the protein expressions of STAT3， pSTAT3 and gp130 were detected by Western blot， and the mRNA expressions of STAT3 and gp130 were analyzed by RT-PCR.

    Results The protein expressions of IL-6， sIL-6R， sgp130， STAT3， pSTAT3 and gp130 in the mild to moderate lung injury group and severe lung injury group were higher than those in the non lung injury group and the control group （P < 0.05）， and the expression levels of IL-6， sIL-6R， sgp130， STAT3， pSTAT3 and gp130 protein in the severe lung injury group were higher than those in the mild to moderate lung injury group （P < 0.05）. In addition， STAT3mRNA and gp130mRNA expressions in the severe lung injury group were higher than those in the other three groups （P < 0.05）.

    Conclusion IL-6/STAT3 signaling pathway can increase the degree of inflammatory reaction by up regulating the expressions of sgp130 and gp130 protein in patients with lung injury induced by paraquat poisoning.

    【Key words】 paraquat; acute lung injury; alveolar lavage; IL-6; STAT3

    百草枯（paraquat，PQ）中毒，由于其组织扩散能力极强，致死剂量又非常小，人体中血液浓度达40 mg/kg左右即为致死剂量，当今临床缺少特效解毒药物，使得PQ中毒的死亡率高达80%，以其高死亡率成为我国重大公共卫生与社会问题[1]。PQ中毒致急性肺损伤（ALI）的相关分子机制的研究涉及的信号通路较多，且各信号通路间存在交互作用，许多具体过程目前仍不清楚[2]，IL-6/STAT3信号通路参与了不同病因导致的ALI的病理生理过程，关于其病理机制的研究结果尚无统一定论[3]。本研究以IL-6/STAT3信号通路为研究对象，对PQ中毒后ALI机体损伤机制进行分析。

    1 资料与方法

    1.1 一般资料

    选取2016年1月～2020年1月我院收治的72例PQ中毒患者作为研究对象，全部患者均口服20%百草枯原液，剂量为20～80 mL，入院时表现为口咽部疼痛、恶心、呕吐、腹痛、黏膜损伤等症状，无肺损伤组24例，男性13例，女性11例，年龄13～61岁，平均（34.85±4.16）岁;轻微-中度肺损伤组24例，男性14例，女性10例，年龄12～62岁，平均（34.33±4.20）岁;重度肺损伤组24例，男性11例，女性13例，年龄14～62岁，平均年龄（34.54±4.13）岁。同时收集22名健康者作为对照组，男性12名，女性10名，年龄12～62岁，平均（34.22±4.13）岁;四组一般资料比较差异均无统计学意义（P>0.05），具有可比性。

    1.2 ALI/ARDS诊断及Murray肺损伤评分标准

    依据1994年欧美联席会议ALI/ARDS诊断标准[4]：（1）急性起病;（2）氧和指数（PaO2/FiO2）≤200 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa），不管吸呼末正壓（PEEP）水平;（3）正位X线胸片显示双肺均有斑片状阴影;（4）肺动脉嵌顿压≤18 mmHg或无左心房压力增高。根据Murray肺损伤评分标准分为：①0分，无肺损伤组;②0.25～2.5分，轻微-中度肺损伤组;③>2.5分，重度肺损伤组。

    1.3 纳入和排除标准

    纳入标准：（1）所有研究对象对于本次研究内容知情并同意;（2）患者服药前无呼吸道疾病，如慢性非阻塞性肺疾病等;（3）研究组患者入院时临床预估其存活时间在24 h以上。排除标准：（1）患者为妊娠期女性;（2）患者伴有严重气胸情况;（3）患者存在造成肺部组织损伤的原发疾病;（4）患者家属不愿参与本次研究。本次研究已获得医学伦理委员会批准。

    1.4 研究方法

    1.4.1 抽取各组外周血

    入院确诊后立即抽取各组外周血10 mL，应用Ficoll分层液法分离外周血获取血清及外周血单核细胞-70℃留存。

    1.4.2 支气管肺泡灌洗、AM分离及培养

    应用支气管肺泡灌洗法采集各组支气管肺泡灌洗液（BALF）20 mL，分离BALF获取上清液及肺泡巨噬细胞（AM）立即-70℃留存。灌洗部位选择右中叶，采用生理盐水进行冲洗，剂量100 mL，温度为37℃，灌洗液回收在6.7～13.3 kPa负压下进行，并采用双层灭菌纱布对回收的灌洗液进行过滤，进行离心处理，转速1200 r/min，4℃下离心10分钟，上清液收缩近5～10倍-70℃贮存待测。沉淀细胞近细胞计数及瑞氏染色分类计数后，用RPMI-1640冲洗2次，然后将AM调整至1×106/mL，加入培养板中，37℃、5%CO2条件下贴壁1小时，去除上清及未贴壁细胞（即AM）在RPMI-1640培养液中，37℃、5%CO2条件下培养24小时，-70℃待测。

    1.4.3 ELISA检测血清IL-6、sIL-6R、sgp130的蛋白表达

    严格按照ELISA说明书操作检测血清上清液中IL-6、sIL-6R、sgp130的蛋白表达。

    1.4.4 Westernblot检测STAT3、pSTAT3、gp130的蛋白表达

    裂解细胞得到蛋白样品并检测浓度，Westernblot检测STAT3、pSTAT3、gp130蛋白表达水平。配制10%分离液，将凝胶固定在电泳装置上，每道上样为30 μg，进行电泳;电泳结束后，将凝胶置于转移缓冲液中30 min;截取PVDF膜使其与凝胶大小一致，另取2张3 M滤纸，浸入转移缓冲液使其浸透;转移结束后将PVDF膜取出，将膜转入新鲜配制的封闭液中4℃温和震荡过夜，弃掉封闭液，按照说明书加入相应比例的一抗，再加入1∶20 000辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗小鼠二抗，TBST洗膜3次，每次5 min去除Tween-20;显影，用Bio-Rda凝胶成像系统照相记录。

    1.4.5 STAT3、gp130mRNA半定量分析RT-PCR

    外周血单核细胞，肺泡巨噬细胞总RNA提取，采用Trizol、氯仿一步法从细胞提取RNA，取细胞RNA1Ug，逆转合成cDNA。SATA3反应条件：94℃，30 s;95℃，30 s;72℃60 s;33个循环后72℃延伸10 min。gp130反应条件：变性温度为95℃，时间为15 min，进一步变性温度为94℃，时间为30 s，退火温度为51℃，时间为30 s，延伸温度为72℃，时间为30 s，以该温度进行33个循环，最后延伸温度为72℃，时间为10 min。取PCR产物上样于10 g/L琼脂糖电泳，应用Primer 5.0软件设计引物，利用天能图像分析系统测定条带的光密度值。

    1.5 统计学方法

    采用SPSS 23.0统计学软件进行数据分析，计量资料符合正态分布，以（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD检验，检验水准：α=0.05，双侧检验。

    2 结? 果

    2.1 IL-6、sIL-6R、sgp130的蛋白表达结果分析

    重度损伤组IL-6、sIL-6R以及sgp130蛋白表达均低于轻微-中度损伤组、无肺损伤组以及对照组（P<0.05），轻微-中度肺损伤组IL-6、sIL-6R以及sgp130蛋白表达均低于无肺损伤组、对照组（P<0.05），无肺损伤组IL-6、sIL-6R以及sgp130蛋白表达低于对照组（P<0.05），随损伤程度加重，IL-6、sIL-6R以及sgp130蛋白表达呈升高趋势。见图1。

    2.2 STAT3、pSTAT3、gp130的蛋白表达结果分析

    重度肺损伤组STAT3/β-actin、pSTAT3/β-actin 以及gp130/β-actin均高于轻微-中度肺损伤组、无肺损伤组以及对照组（P<0.05），轻微-中度肺损伤组STAT3/β-actin、pSTAT3/β-actin以及gp130/β-actin均高于无肺损伤组、对照组（P<0.05），无肺损伤组STAT3/β-actin、pSTAT3/β-actin以及gp130/β-actin高于对照组（P<0.05），PQ中毒患者STAT3/β-actin、pSTAT3/β-actin以及gp130/β-actin高于对照组，且随肺损伤程度加重而呈现表达升高趋势。见图2、表2。

    2.3 STAT3mRNA、gp130mRNA表达结果

    重度肺损伤组STAT3mRNA、gp130mRNA均高于轻微-中度肺损伤组、无肺损伤组以及对照组（P<0.05），轻微-中度肺损伤组STAT3mRNA、gp130mRNA均高于无肺损伤组、对照组（P<0.05），无肺损伤组STAT3mRNA、gp130mRNA高于对照组（P<0.05），PQ中毒患者STAT3mRNA、gp130mRNA高于对照组，且随肺损伤程度加重而呈现表达升高趋势。见表3。

    3 讨? 论

    国内研究显示，PQ中毒发生比例占急性农药中毒的33.60%左右，且呈逐年上升趋势，死亡率也居高不下[5]。PQ中毒属于临床危重症，诸多学者一直致力于其治疗方案研究，也制定了众多的专家指南共识，但是到目前为止尚无统一治疗方案，临床大多以洗胃、导泻、灌肠、补液、利尿、纠正水电解质紊乱等对症处理方法进行治疗为主[6]。究其原因，主要是因为PQ中毒机制极其复杂，至今尚未完全阐述清楚[7]。关于PQ中毒致肺损伤的相关机制主要有以下几方面观点：①毒物在肺组织中蓄积。PQ经消化道、呼吸道以及皮肤等进入人体后分布在骨骼、肝脏、肺部以及肾脏位置，PQ可与胺类物质竞争通过肺泡Ⅱ型细胞的能量依赖性多胺摄取途径而选择性地在肺内聚集，其在细胞膜上可与多胺类物质竞争而被细胞摄取。这种摄取集中于肺部Ⅱ型细胞内，同时在器官C蜡染细胞以及肺泡Ⅰ型细胞内存在。②氧自由基损伤。集中在肺组织以后，通过NADPH辅助單电子还原成为自由基，随后同分子氧之间发生反应产生超氧阴离子以及联吡啶阳离子，使其膜功能与结构发生变化。③脂质过氧化损伤。在PQ12 h暴露肺泡巨噬细胞显示脂质过氧化物，损伤线粒体，促使重要组成部位中毒。④胞内钙稳态失衡。PQ中毒以后肺组织细胞中的胞浆内钙离子浓度持续上升，通过实施金属离子鳌合剂乙二胺四乙酸以后，出血以及充血情况均得到显著缓解。⑤炎性细胞。PQ中毒早期阶段存在大量免疫细胞浸润以及炎性细胞浸润，从而分泌大量递质。并且炎性细胞存在肺泡表面聚集是早期阶段主要特征，将氧自由基加以释放，防止PQ急性肺损伤。

    随着医学研究的不断拓展，越来越多的研究指出，在调控ALI过程中信号转导与转录活化因子3（signal transduction transcription activator 3，STAT3）的激活起到非常重要的作用[8]。STAT3主要存在于胞浆中，其构象在启动因子的刺激下会发生改变，序列暴露后，STAT3可获得核定位信号，促进STAT3进入细胞核内，对于细胞增殖、分化以及凋亡等过程起到调控作用[9]。STAT3与其他分子形成的受体复合物是通过识别细胞表面糖蛋白gp130进行的，使Src、Jak等酪氨酸蛋白激酶被激活，对于STAT到受体胞质区磷酸化的酪氨酸残基上起到募集作用，在磷酸化TAT蛋白上的酪氨酸后进行蛋白质激活[10]。在STAT3活化后会形成二聚体，转位进入细胞核与DNA反应元件进行特异性结合，使下游靶基因转录启动。STAT3属于一组多样性蛋白质，对于多种炎性反应可以起到激活作用，促进肺组织的炎性损害。有报道指出，将小鼠STAT3敲除，小鼠可快速出现肺泡渗出情况，甚至会出现急性呼吸衰竭，且敲除STAT3的小鼠，炎症反应以及肺损伤情况都比未敲除小鼠严重[11]。

    有报道指出，PQ中毒患者IL-18表达均高于健康对照组，且随肺组织损伤加重呈现IL-18表达明显升高情况[12]。STAT3在肺中和肺泡巨噬细胞有IgG复合物的组织均存在激活情况，但是时间框不同，其激活是靠不同因子来实现[13]。在IgG免疫复合物诱导的肺损伤中抗IL-6抗体对于STAT3在肺泡上皮细胞的激活起到抑制作用，因此，IL-6可能是通过激活STAT3而起到抗炎作用[14]。已有研究指出，STAT3在出血性休克以及脂多糖导致的肺损伤中也存在激活情况，IL-6不是通过脂多糖激活STAT3，而是在肺内皮细胞以及上皮细胞上激活，对IL-6/STAT3信号通路的激活进行全面抑制，对于脂多糖导致脓毒血症以及肺损伤可以起到有效对抗作用[15]。STAT3在出血性休克康复的大鼠肺组织中存在被激活情况，且IL-6表达水平明显升高。也有学者研究指出，选取IL-6基因敲除大鼠以及IL-6基因转染大鼠作为研究对象，结果显示，重症胰腺炎导致肺损伤大鼠存在IL-6以及IL-6受体表达升高情况，并且可通过IL-6反式信号使STAT3上调，对核转录因子κB（nuclearfactor-κ-genebinding，NF-κB）起到激活作用，加重肺组织炎性损伤[16]。

    本研究表明，轻微-中度肺损伤组、重度肺损伤组IL-6、sIL-6R、sgp130、STAT3、pSTAT3、gp130的蛋白表达明显高于无肺损伤组、对照组，且重度肺损伤组IL-6、sIL-6R、sgp130、STAT3、pSTAT3、gp130蛋白表达水平较轻微-中度肺损伤组差异有统计学意义;重度肺损伤组STAT3mRNA、gp130mRNA表达较其他3组，差异均有统计学意义。说明重度肺损伤组IL-6/STAT3信号通路被激活而表达上调，与以往研究保持一致。

    综上所述，PQ中毒肺损伤患者中IL-6/STAT3信号通路通过上调sgp130、gp130蛋白的表达，升高炎症反应程度，对肺组织造成损伤。

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    （收稿日期：2020-07-07 修回日期：2021-02-03）

    基金项目：广西急诊与医学救援人才小高地、广西高校急诊医学重点实验室开放课题（GXJZ201623）;广西卫生和计划生育委员会自筹经费课题（Z2016181）

    作者简介：李激文，男，副主任医师，医学学士，研究方向：急救医学、中毒。E-mail：13557025190@qq.com

    通信作者：黎宇。E-mail：liyu821010@163.com

    [本文引用格式]李激文，钟雨，刘华，等.IL-6/STAT3信号通路在百草枯中毒急性肺损伤中作用机制的研究[J].右江医学，2021，49（3）：172-177.