固相萃取-超高效液相色谱-串联质谱法分析土壤中15种全氟化合物

    谢琳娜 张海婧 侯沙沙 朱英

    

    

    

    摘?要?建立了土壤中15种全氟化合物（PFAAs）的固相萃取超高效液相色谱-串联质谱（SPE-UPLC-MS/MS）分析方法。取1 g样品，经超声提取、固相萃取柱净化后，在负离子扫描和多反应监测模式（MRM）下，采用UPLC-MS/MS进行测定。对溶剂体积、超声时间以及固相萃取条件进行了优化，结果表明，采用2 mL含有 1%氨水的甲醇溶液超声处理15 min，后经ENVI-Carb固相萃取小柱经甲醇和0.1%氨水/甲醇溶液依次淋洗，前处理效果最佳。15种PFAAs在0.01～5 ng/mL质量浓度范围内线性良好，r均大于0.998，方法检出限在0.002～0.016 ng/g之间，定量限在0.006～0.050 ng/g之间。 方法加标回收率在75.8%～113.0%之间，相对标准偏差小于15%。对实际土壤样品进行了测定，并与文献报道的方法对比，本方法可达到与已知方法相当甚至更好的测定效果。对国际认可的质控样品NIST SRM 2586中全氟化合物进行测定，结果在质控范围之内，也证明了方法的可行性。本研究建立了土壤中15种全氟化合物的超声提取方法，溶剂使用量少、前处理时间短，可对土壤中全氟化合物进行准确定量测定。

    关键词?全氟烷酸; 土壤; 固相萃取; 超声提取; 超高效液相色谱-串联质谱

    1?引 言

    全或多氟烷酸（Per-?and polyfluoroalkyl acids，PFAAs）是一类碳原子上的氢原子全部或部分被氟原子取代的脂肪羧酸或磺酸基化合物。PFAAs因含高键能的碳氟键（CF），具有很强的稳定性，难以光解、水解和被生物降解[1，2]。PFAAs作为一类重要的表面活性剂，自20世纪50年代开始大量生产。2000年全球全氟辛烷磺酸（PFOS）的产量约为3545 t，2002年全球全氟辛烷磺酸鹽的产量约为4500 t，据估计全氟辛烷羧酸（PFOA）每年的产量超过500 t[3]。1951～2004年，全球全氟羧酸类（PFCAs）化合物产量估计为4400～8000 t[4]。PFAAs的大量生产和使用，导致全球范围内PFAAs在各种环境介质、食品、生物体和人体中被广泛检出[5～8]。流行病学研究表明，人体暴露于PFAAs，会影响肝脏、胃和甲状腺功能[9，10]，胆固醇水平升高、癌症、肥胖、免疫抑制、内分泌紊乱等疾病的发生也与PFAAs有关[11]。毒理学研究表明，PFAAs可与血清中脂蛋白、白蛋白、肝蛋白、甲状腺激素T3受体和转运蛋白结合[12～15]。2009年，PFOS及其盐类作为新增的持久性有机污染物，被联合国环境规划署列入POPs名单。2015年，PFOA及其盐类也被提议列入POPs[16]。

    目前，针对PFAAs的监测研究多集中在水体和生物体中，土壤中的监测研究报道相对较少[17]。土壤中的PFAAs可通过植物或动物进入食物链，并产生生物放大效应，给人类生存和健康带来风险。美国环保局（USEPA）针对住宅用地中的PFOA和PFOS分别设定了16000 ng/g和6000 ng/g的限值[18]; 澳大利亚政府则针对不同用途的土壤给出了PFOA和PFOS的临时参考限值[19]。我国尚未制定土壤中PFAAs的限量标准。据已有的监测数据显示，土壤中PFOA的浓度水平为3.28～298 ng/g; PFOS 的浓度水平为8.58～173 ng/g; 但在氟化工厂土壤中，PFAAs的总量可高达913 ng/g[20～24]。尽管与国际标准相比，国内土壤中PFAAs的浓度水平不高，但污染区的浓度仍超过清洁土壤的要求，持续监测非常必要。

    文献报道的PFAAs检测方法[18，25～28]以液相色谱-串联质谱（HPLC-MS/MS）为主，前处理方法包括加速溶剂提取法、超声提取法和振荡提取法等。常用的有机提取溶剂多为甲基叔丁基醚、乙腈、甲醇，以及在乙腈或甲醇溶剂中加入氨水、氢氧化钠溶液等[2，29]。存在的主要问题是消耗溶剂体积多，1 g土壤采用10 mL甲醇溶剂提取[18]; 用时长，单次溶剂提取时间为0.5～3 h[27，28]，不适合大量样品的检测要求; 前处理方法繁琐，需同时采用超声和振荡提取等[27，28]; 可检测的目标物种类较少[30]等。

    本研究通过优化前处理方法，缩短前处理时间，减少有机溶剂用量，建立了经济、快速、准确的土壤中全氟化合物的分析方法，对土壤标准物质和实际土壤样品的检测结果令人满意。

    2?实验部分

    2.1?仪器与试剂

    液相色谱-串联质谱联用系统：API 4000 三重四极杆质谱仪（美国AB sciex公司）、Acquity I Class 超高效液相色谱仪（美国Waters 公司）; 24位固相萃取干燥装置（美国Supelco公司）; 600 C离心机（北京白洋医疗器械有限公司）; MUTIVAPEFCG-11848氮吹仪（美国Organomation公司）; MS2涡流振荡器（美国Scientific Industries公司）; PALL Cascada超纯水机（美国PALL公司）。

    甲醇、水（LC-MS级，德国Merck公司）; 乙酸铵（LC-MS级，美国Fisher Chemical公司）;?实验用水为超纯水（18.2 MΩ cm）; 15种全氟化合物混合标准溶液（PFAC-MXC）、13种全氟化合物混合内标溶液（MPFAC-C-ES）（加拿大Wellington Laboratories公司）。Standard Reference Material 2586 （土壤，美国National Institute of Standards and Technology公司）。

    2.2?实验方法

    2.2.1?标准溶液配制?将浓度均为2.00×103 ng/mL的15种PFAAs混合标准溶液和13种PFAAs混合内标溶液，用甲醇稀释为100和10.0 ng/mL的标准中间液和25.0 ng/mL的混合内标溶液，于20℃储存，备用。15种PFAAs的具体信息及质谱参数见表 1。

    2.2.2?样品前处理

    称取1 g土壤样品（精确至0.01 g），加入含1%氨水的甲醇溶液，40℃水浴超声15 min，4000 r/min离心10 min，吸取上清液。重复两次，合并上清液，40℃下氮吹至干，用含200 μL 1%乙酸的甲醇溶液中和，后用1 mL甲醇复溶。

    固相萃取柱SupelcleanTM ENVI-CarbTM （6 mL，500 mg，美国SUPELCO公司）先用1 mL 0.1%氨水的甲醇溶液处理，再用1 mL甲醇处理，各重复2次，进行活化，备用。加入1 mL甲醇复溶样品，减压快速流出，再分别用1 mL甲醇和1 mL 0.1%氨水的甲醇溶液洗脱，各重复3次，收集洗脱液，氮吹至干，用200 μL甲醇溶液定容，4000 r/min离心10 min，吸取上清液进行分析。

    2.2.3?测定条件

    色谱条件?Waters ACQUITY UPLC BEH C18 色谱柱 （100 mm 2.1 mm，1.7 μm），柱温40℃，进样量： 10 μL; 流速300 μL/min; 流动相： 2 mmol/L乙酸铵（A）-甲醇（B）; 梯度洗脱条件： 0 min，10% B; 1.0 min，20% B; 4.0～6.0 min，90% B; 6.1～8.0min，10% B。质谱条件?离子化方式： 电喷雾（ESI）离子源; 负离子多反应监测（MRM）扫描; 碰撞气（CAD）： 83 kPa; 气帘气（CUR）： 103 kPa; 雾化气（GS1）： 345 kPa; 加热气（GS2）： 241 kPa; 喷雾电压（IS）： 4000 V。

    2.2.4?质量保证和质量控制?实验过程避免使用聚四氟乙烯材質的色谱管路与器皿。样品前处理和分析过程中使用的离心管、塑料滴管、枪头、进样小瓶、管线均做空白对照试验，未检出15种待测PFAAs。流动相采用LC-MS级甲醇和水。2 mmol/L乙酸铵溶液用LC-MS级乙酸铵配制，现用现配。

    3?结果与讨论

    3.1?条件优化

    3.1.1?超声提取条件?称取1 g土壤样品（精确至0.001 g），分别加入2、4 和6 mL含1%氨水的甲醇溶液，在40℃水浴中超声15、30和60 min，考察提取溶液体积和超声时间对提取效率的影响（图1）。结果表明，提取溶液体积和超声时间对提取效率的影响很小，2 mL提取溶液和15 min超声提取时间即可满足要求。

    3.1.2?固相萃取条件?选择ENVI-Carb固相萃取小柱，对经过超声提取复溶的样品进行净化，考察洗脱液种类和用量对洗脱效果的影响。选择的洗脱液包括1 mL乙腈、1 mL甲醇、1 mL甲醇-1 mL 0.1%氨水甲醇、2 mL甲醇-2 mL 0.1% 氨水甲醇和1 mL甲醇-1 mL 1% 氨水甲醇，重复2次。结果表明，用1 mL甲醇-1 mL 0.1% 氨水甲醇溶液即可达到满意的洗脱效果（图2，ACN为乙腈，M为甲醇）。

    3.1.3?质谱条件优化

    取2.00 ng/mL 混合标准溶液，采用流动注射方式，以10 μL/min 流速进样，在负离子模式下进行全扫描，以选择目标化合物理想的分子离子峰[M-H]; 以目标化合物的[M-H]为母离子进行子离子扫描，选择丰度较高、干扰较少的两个子离子，优化碰撞能量（CE）和去簇电压（DP），结果见表1。以多反应监测（MRM）方式优化气帘气（CUR），碰撞气（CAD）、雾化气（GS1）、辅助气（GS2）、离子源电压（IS）和离子化温度（TEM）等参数。色谱分离结果见图3（1 g土壤基质中加入0.200 ng的全氟化合物标准溶液）。

    3.2?基质效应评价

    分别采用标准曲线和工作曲线测定实际样品评价绝对基质效应。结果表明，采用不同曲线时，样品测定结果的相对标准偏差<5%，且统计结果无显著性差异，说明基质效应不明显。收集6个不同来源的实际土壤样品，每个样品中加入浓度相同的内标，通过比较内标峰面积的稳定性评价相对基质效应。结果表明，6个土壤样品中内标的质谱响应稳定，峰面积相对标准偏差在2.4%～9.0%之间，说明相对基质效应稳定。为节约时间、降低实验成本，实际样品测定过程中采用标准曲线进行定量分析。

    3.3?方法的分析特性

    分别配制系列浓度为0.010、0.025、0.050、0.100、0.250、0.500、1.00、2.50和5.00 ng/mL的标准溶液，内标浓度为2.50 ng/mL，绘制标准曲线。 15种PFAAs的线性范围在0.01～5.00 ng/mL之间，相关系数大于0.998，具体结果见表2。

    在空白土壤样品中加入0.010、0.025、0.050、0.100、0.250、0.500、1.00、2.50和5.00 ng/mL的混合标准溶液和2.50 ng/mL内标溶液，进行前处理和分析，绘制工作曲线，以3倍信噪比计算方法检出限（LOD），10倍信噪比计算定量限（LOQ）。 方法的LOD值在0.002～0.016 ng/g之间，LOQ在0.006～0.050 ng/g之间，与文献报道方法（Zhu等[31]，LOD： 0.035～0.136 ng/g，LOQ： 0.115～0.452 ng/g; Liu等[24]，LOD： 0.002～0.01 ng/g，LOQ： 0.01～0.04 ng/g）相当或更低。

    称取1 g空白土壤（精确至0.001g），分别添加0.040、0.200和0.400 ng/g浓度水平的PFAAs，每个水平平行测定6次，计算方法加标回收率和相对标准偏差（RSD）。结果表明，15种PFAAs的加标回收率在75.8%～113.0%之间，RSD在4.1%～13.8%之间，能够满足定量分析的基本要求。

    3.4?方法正確度及优势评价

    3.4.1?NIST质控样品测定?采用所建立的方法对含PFOS的NIST SRM 2586质控样品进行了5次测定，RSD（日间精密度）为4.6%，测定结果均在质控样品的给定浓度范围2.08～4.74 ng/g内，说明方法的正确度好，这是首次采用NIST质控样品对土壤中全氟化合物的分析方法进行正确度评价。

    3.4.2?方法比对

    对本方法和文献报道的前处理方法进行了比较。具体前处理方法分别为： （1） 10 mL甲醇40℃超声提取30 min[18，25]; （2）2 mL乙腈40℃超声提取30 min[26]; （3） 5 mL 200 mmol/L NaOH乙腈溶液40℃超声提取30 min，振荡（250 r/min）提取30 min[28]; （4） 4 mL 1%氨水甲醇溶液40℃超声提取60 min，振荡（250 r/min）提取120 min[27]; （5） 2 mL 1%氨水甲醇溶液40℃超声提取15 min。由图4可知，本方法可达到与文献报道的方法相同甚至更佳的结果，与文献方法相比，提取时间更短，提取溶液用量更少，在土壤样品的大批量测定中有明显优势。

    4?结 论

    建立了土壤中15种PFAAs的分析方法。方法的检出限在0.002～0.016 ng/g之间，定量限在0.006～0.050 ng/g之间，加标回收率为75%～113%。通过测定NIST SRM 2586质控样品，评价了方法的正确度。与文献报道的方法相比，本方法操作简便，超声提取时间短，提取溶液使用量少，可同时分析15种全氟羧酸和全氟磺酸化合物，能够满足实际土壤样品的大批量测定的需求。

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