EZH2通过抑制LncRNA而抑制烧伤后皮肤成纤维细胞增殖的机制研究

    谭成波

    

    

    

    [关键词]EZH2;lncRNA;烧伤;成纤维细胞;增殖

    肉芽组织形成过程中，需要成纤维细胞对组织进行调节形成收缩[1]。在创伤愈合过程中，成纤维细胞形成第一次转变，转变为成肌纤维细胞，在后期瘢痕增生中起到重要作用[2-4]，成纤维细胞内部属性的变化与生长因子和细胞因子有一定的相关性[5-6]。lncRNA主要是对合成过程中激活、转录干扰和核内运输等进行调控[7-8]，其可通过启动反式作用影响蛋白质的修饰[9-10]。12号染色体通过转录就可生成的反式lncRNA，HOX基因转录本反义基因间RNA（HOXtranscript antisense intergenic RNA，HOTAIR），HOTAIR在上皮性癌细胞中的异位表达，在全基因组范围内招募PRC2形成早期的成纤维细胞，导致组蛋白H3赖氨酸27甲基化、基因表达的改变[11]。EZH2是PRC2[11]的一个关键组成部分。EZH2与HOTAIR和Xist相互作用，调节基因表达[12-13]。相关研究表明[12]，HOTAIR与PRC2相互作用，选择性地抑制基因表达。PRC2和赖氨酸特异性脱甲基酶1（LSD1）的引入抑制了染色体2上的40000BP H OX基因，并导致组蛋白抑制标记H3K27me3的出现和组蛋白H3at赖氨酸4的三甲基化，3K4ME3丢失[14]。异位H19的表达增强了肿瘤细胞在体内的致瘤潜能[14]，却对成纤维细胞有着抑制增殖的作用。本研究探讨lncRNA-H19介导的组蛋白甲基化酶EZH2与烧伤后皮肤成纤维细胞增殖的关系。

    1 资料和方法

    1.1 标本来源：选取2013年6月-2016年5月于笔者医院就诊的8例烧伤瘢痕患者皮肤标本，将这些组织切除，并于-80℃液氮中冷冻以供进一步使用。所有患者均未使用过激素、中药、放疗或化疗。瘢痕组织符合患者和观察者瘢痕评定分级标准，均由烫伤或烧伤形成，术前均经患者知情同意，该试验方案均经过医院伦理委员会批准。对照组取自8例正常成熟皮肤、8例成熟纤维组织。

    1.2 方法

    1.2.1 细胞培养：用PBS冲洗烧伤组织及邻近组织3次。用0.25%胰蛋白酶消化组织，移除上皮。组织匀浆后，用0.1%Ⅰ型Colla-genase（C-0130;Sigma-Aldrich;Merck KGaA，Darmstadt，德国）在37℃下振荡3h消化组织。将样品与等量的DMEM培养基（DMEM;SH 30023.01B;Hyclone;GE保健生命科学，Logan，UT，美国），10%胎牛血清（H30084.03;HyClone，GE保健生命科学）混合培养。在室温下300g离心10min后，去掉清液，成纤维细胞被重新悬浮在高糖DMEM中。成纤维细胞接种于直径100mm、密度为4×104/cm2的培养板上，在37℃、5% CO2和100%湿度下培养24h。24h后开始更换，随后每3d更换一次。取经过3次传代培养的细胞用于本实验研究。

    1.2.2 细胞的转染与分组：脂质体介导的siRNA干扰以脂质体为标准，制备转染试剂与200LL小干扰RNA（siRNA）混合的复合物。N e 2 0 0 0 转染试剂盒（ 1 1 6 6 8 0 1 9 ;Invitrogen ThermoFisher Science，Waltham）并添加到培养基中。以转染的无干扰siRNA为对照。转染后，将细胞置于37℃的5% CO2孵化器中孵育6h，在含10% FBS血清的1.5ml正常培养基中培养。随后将此部分细胞分配到空白组（未转染）、阴性对照组（转染非特异性siRNA）、siRNA H19组、siRNA-EZH2组和siRNA H19+siRNA-EZH2组。并合成siRNA的引物序列。上海基因制药有限公司（中国上海）。siRNA-NC的上游序列为5-UUCUCCGAACGUGUCACGUU-3，下游序列为5-ACGGACACGUCGGAAU-3;siRNA HOTAIR为5-UUUCUCUAGGUGGUAC-3，下游序列为5-AUUUUUAAUAUGCUGCUG-3。SIEZH2的上游序列为5-TTCATGACAACACCACAT-3，以及下游序列为5-GAGAGCAGCGACAACTCCT-3。见表1。

    1.2.3 实时荧光定量PCR（Real-time PCR，RT-PCR）检测：收集转染1d后的成纤维细胞用Trizol Rea（A33254;Thermo Fisher Scientific，Waltham）提取上述细胞的总RNA。并用超微分光度计（NanoDrop2000;ThermoFisher）测定其浓度和纯度，使用反转录试剂盒（Promega）进行反转录。建立了逆转录-定量聚合酶链反应（RT-qPCR）体系和PCR反应程序PCR扩增条件为：95℃预变性1min，95℃变性30s，72℃延伸60s，58℃退火5s，重復30个循环，最后72℃延伸10min，以GAPDH的表达为参考，根据相对定量公式2-△△Ct，计算了H19的相对表达量，对所得结果进行统计分析。

    1.2.4 MTT法检测细胞的增殖：在对数生长期收集成纤维细胞，在细胞生长培养基中重新培养，接种96孔板，细胞密度为1×104/ml。每组细胞设置8个复孔进行质粒感染，在正常培养基中连续培养24h、48h和72h。每孔去培养液用PBS洗涤三次后加入MTT（5mg/ml）20μl继续培养，终止培养后，将孔内上清液去掉，每孔加入150μlDMSO，震荡使晶体充分溶解，酶标仪上检测波长为490nm的吸光值。

    1.2.5 Western blot检测：采用上述方法检测转染后血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）和mTOR的表达。于转染72h后收集细胞，按照说明书使用蛋白提取试剂盒提取蛋白。经BrADFED定量分析后，进行SDSPAGE凝胶电泳，湿转化、膜封闭、过夜抗体、VEGF、雷帕霉素靶蛋白（哺乳动物靶向雷帕霉素、mTOR）和靶抗体法HRP标记两种抗体（康世纪）在室温下孵育1h，洗膜后ECL呈彩色。图像软件灰色分析结果，GAPDH作为内部参考，测定H19 siRNA、EZH2siRNA、H19siRNA+EZH2siRNA转染组VEGF、mTOR的表达量。