舌鳞状细胞癌组织中FIP200与ATG7的表达水平研究
罗婕瑜 刘发煇 黄春英 姚金光
【摘要】 目的 通过免疫组化法检测舌鳞状细胞癌（tongue squamous cell carcinoma，TSCC）患者癌组织及癌旁组织中的200 kDA的家族相互作用蛋白（family interacting protein of 200 kDA，FIP200）、自噬相关基因7（autophagy related gene 7，ATG7）的表达，并分析FIP200、ATG7在不同分组的TSCC中的表达情况，为TSCC的靶向治疗提供前期实验依据。
方法 选取2012年～2019年就诊的36例TSCC手术患者的石蜡标本用于FIP200免疫组化染色;34例TSCC手术患者的石蜡标本用于ATG7免疫组化染色。以癌组织作为实验组，同一切片的癌旁组织作为对照组，随机选取镜下视野求出面密度值作为FIP200、ATG7的表达情况。收集对应患者的临床资料并分析FIP200、ATG7表达与患者临床病理特征的关系。使用 STRING网站构建蛋白质蛋白质相互作用网络，分别分析與ATG7、FIP200相互作用最为密切的10个蛋白，使用生物信息学分析软件FunRich对2个基因集分别进行生物信息学富集分析。
结果 ATG7 及 FIP200在TSCC组织中的表达高于癌旁组织（P<0.05）;ATG7在不同分化等级的癌组织中的表达水平不同，分化等级越高，ATG7的表达水平越低（P<0.05）;与ATG7相互作用的10个蛋白分别是GABARAPL2、MAP1LC3B、BECN1、ATG10、GABARAP、ATG12、GABARAPL1、ATG3、MAP1LC3A和ATG5，ATG7作为RIGI/MDA5信号通路的负调节因子发挥作用（P<0.05）;与FIP200相互作用的10个蛋白分别是BECN1、ULK2、ULK1、PIK3C3、ATG101、ATG13、ATG16L1、ATG14、PIK3R4和ATG5，FIP200主要参与细胞中ULK1ATG13FIP200复合体以及自噬小体的组成（P<0.001）。
结论 ATG7 及 FIP200 在TSCC组织中的表达高于癌旁正常组织;ATG7表达与TSCC的恶性程度有关;ATG7作为RIGI/MDA5信号通路的负调节因子在生物学过程中发挥作用;FIP200参与ULK1ATG13FIP200复合体以及自噬小体的组成，对细胞自噬产生影响。
【关键词】 FIP200;ATG7;TSCC;发病机制;生物信息学
中图分类号：R730.2 文献标志码： DOI：10.3969/j.issn.10031383.2021.06.003
Study on the expression of FIP200 and ATG7 in tissues of tongue squamous cell carcinoma
LUO Jieyu1， LIU Fahui2， HUANG Chunying1， YAO Jinguang1▲
（1. Department of Stomatology， 2. Department of Pathology， Affiliated Hospital of Youjiang Medical University for Nationalities， Baise 533000， Guangxi， China）
【Abstract】 Objective To detect the expressions of family interacting protein of 200 kDa （FIP200） and autophagy related gene 7 （ATG7） in tissues and paracancerous tissues of tongue squamous cell carcinoma （TSCC） patients by immunohistochemistry， and to analyze the expressions of FIP200 and ATG7 in different groups of TSCC， so as to provide a preliminary experimental basis for targeted treatment of TSCC.
Methods Paraffin specimens of 36 TSCC patients admitted to hospital from 2012 to 2019 were used for FIP200 immunohistochemical staining， and paraffin specimens of 34 TSCC patients were used for ATG7 immunohistochemical staining. Cancer tissues were used aexperimental group， paracancerous tissues in the same sections were used as control group， and the area density value of the field of vision under microscope was randomly selected as the expressions of FIP200 and ATG7. The clinical data of the corresponding patients were collected， and the relationship between the expressions of FIP200 and ATG7 anclinicopathological characteristics was analyzed. Proteinprotein interaction network was constructed by STRING website， and 10 proteins that interacted most closely with ATG7 and FIP200 were analyzed， respectively. FunRich （a bioinformatics analysis software） was used to conduct bioinformatics enrichment analysis on two gene sets， respectively.
Results The expressions of ATG7 and FIP200 in TSCC tissues were higher than those in paracancerous normal tissues （P < 0.05）; the expression levels of ATG7 were different in cancer tissues with different grades of differentiation， the higher the grade of differentiation， the lower the expression level of ATG7 （P < 0.05）; 10 proteins that interacted with ATG7 were GABARAPL2， MAP1LC3B， BECN1， ATG10， GABARAP， ATG12， GABARAPL1， ATG3， MAP1LC3A and ATG5， and as a negative regulator of RIGI/MDA5 signaling pathway， ATG7 played a role （P < 0.05）; 10 proteins that interacted with FIP200 were BECN1， ULK2， ULK1， PIK3C3， ATG101， ATG13， ATG16L1， ATG14， PIK3R4 and ATG5， and FIP200 was mainly involved in the composition of ULK1ATG13FIP200 complex and autophagosome （P < 0.001）.
Conclusion The expressions of ATG7 and FIP200 in TSCC tissues are higher than those in paracancerous normal tissues， and the expression of ATG7 is related to the malignant degree of TSCC. As a negative regulator of RIGI/MDA5 signaling pathway， ATG7 plays a role in biological processes. FIP200 is involved in the composition of ULK1ATG13FIP200 complex and autophagosome， and affects autophagy.
【Key words】 FIP200; ATG7; TSCC; pathogenesis; bioinformatics
過去40年中，全球范围内大多数地区舌鳞状细胞癌（tongue squamous cell carcinoma，TSCC）的发病率以每年 0.4%至3.3%的速度增长，一些国家的发病率甚至增加了4倍。目前手术治疗联合放、化疗是治疗TSCC的首选方法，但TSCC患者的复发率与病死率仍居高不下，预后较差。因此，对TSCC的分子机制进行进一步研究，寻找TSCC的新的治疗靶点具有重要意义。自噬是一种高度保守的溶酶体介导的保护细胞的过程。目前在许多肿瘤中都发现了自噬活性失调[1～2]，调节自噬可以作为癌症治疗的有效干预策略[3]。细胞自噬与靶向抗癌药物之间的作用机制十分复杂，关于TSCC自噬机制的研究可以进一步推进抗癌药物的研发，从而寻找一种有效地提高患者生存率的治疗方法。既往研究发现，200 kDA的家族相互作用蛋白（family interacting protein of 200 kDA，FIP200）、自噬相关基因7（autophagy related gene 7，ATG7）在肿瘤的发生、发展过程中扮演非常重要的角色。但它们在TSCC中的作用尚不清楚。本实验通过研究FIP200、ATG7在TSCC组织中的表达情况，分析FIP200、ATG7在TSCC组织与癌旁正常组织中的表达差异及它们与临床病理特征的关系，并通过生物信息学分析进一步探讨它们在舌癌中的作用机制，以期为TSCC的靶向治疗及临床诊断提供新的靶点。
1 材料与方法
1.1 实验标本来源
选取2012年～2019年于右江民族医学院附属医院就诊的36例TSCC手术患者的石蜡标本用于FIP200免疫组化染色;34例TSCC手术患者的石蜡标本用于ATG7免疫组化染色。纳入标准：所有患者均为初次治疗;术前均未接受放疗、化疗;术前均未使用靶向抗癌药物;原发病灶为TSCC;病理类型为TSCC;病理标本切片经HE染色后镜下观察，需同时包含有TSCC组织及癌旁组织。排除标准：患者术前曾接受放化疗、化疗;术前曾使用靶向抗癌药物;合并严重并发症影响预后;TSCC为转移病灶;病理类型为非鳞状细胞癌或非舌部组织鳞状细胞癌;患者病理标本切片经HE染色后镜下观察，坏死组织较多或不含有TSCC组织或癌旁组织。本研究经右江民族医学院附属医院伦理委员会审核批准。
1.2 免疫组织化学染色
采用免疫组化法检测FIP200及ATG7在TSCC组织及癌旁正常黏膜组织中的表达，具体实验步骤严格按试剂盒上的说明进行（其中FIP200及ATG7抗体工作浓度均为 1∶100）。脱蜡至水、枸橼酸盐加热抗原修复，用 PBS代替一抗作为阴性对照，常规 DAB 显色，苏木精对比染色，返蓝后使用中性树胶封片。
1.3 免疫组化结果评价方法
评价采用半定量法，在胞膜或胞质中出现淡黄色即可记为阳性。每例标本于低倍镜下对组织病理切片作全面观察，按照抗体使用说明书设置宫颈癌标本为ATG7阳性对照组，肾小球标本为FIP200阳性对照组。ATG7组及FIP200组内每张切片至少随机挑选3个200倍镜下视野进行拍照，其中包括癌组织和癌旁组织。使用光密度分析软件：Imagepro plus 6.0选择相同的棕黄色作为判断所有照片阳性的统一标准，并通过分析每张照片拍摄组织阳性的累积光密度值（IOD）和像素面积（AREA），并计算面密度（areal density），areal density=IOD/AREA，面密度值越大表明阳性表达水平越高，肿瘤免疫组化染色后面密度值结果根据中位数分为高低表达组。
1.4 统计学方法
使用SPSS 16.0统计学软件进行统计学分析。符合正态分布的计量资料使用均数±标准差（±s）表示，多个样本均数比较采用单因素方差分析，组间比较采用配对样本t检验，计数资料的组间比较采用四格表资料确切概率法，检验水准：α=0.05，双侧检验。在STRING11.0数据库中设置最低相互作用分值为0.4，分别构建ATG7与FIP200两个基因的蛋白相互作用网络。ATG7、FIP200蛋白相互作用网络中的基因以P<0.05作为基因本体富集分析显著性标准。
2 果
2.1 免疫组化结果分析
经免疫组织化学法染色后镜下观察到：ATG7及FIP200主要表达于细胞浆。镜下表现为细胞浆呈棕黄色或棕褐色染色，细胞核呈蓝色。对比阳性对照组的结果（图1A、B），在200倍镜下每张切片随机选取了至少3个视野进行观察，可以发现FIP200与ATG7均在癌旁组织中染色较浅（图1C、D），在癌组织中细胞浆染色更深（图1E、F）。
2.2 FIP200面密度值与临床病理特征分析
实验结果表明FIP200在TSCC组织的面密度值为（0.0384±0.0301），在癌旁正常组织中的面密度值为（0.0036±0.0028），两组相比差异有统计学意义（t=6.906，P0.05），见表1。
2.3 ATG7面密度值与临床病理特征分析
实验结果表明ATG7在TSCC组织的面密度值为（0.1257±0.0960），在癌旁正常组织中的面密度值为（0.0208± 0.0172），两组相比差异有统计学意义（t=6.272，P0.05），见表2。进一步分析表明中低分化的TSCC组织中ATG7的面密度值为（0.1918±0.0782），高分化组中ATG7的面密度值为（0.0941±0.0884），癌旁组织中ATG7的面密度值为（0.0208±0.0172），组间比较差异有统计学意义（F=34.51，P<0.0001），见图2。
2.4 FIP200与ATG7基因富集分析结果
基因富集分析结果显示，与FIP200相互作用的10个蛋白分别是BECN1、ULK2、ULK1、PIK3C3、ATG101、ATG13、ATG16L1、ATG14、PIK3R4和ATG5，它们主要参与了细胞中ULK1ATG13FIP200复合体以及自噬小体组成（P<0.001），见图3和图4;与ATG7相互作用的10个蛋白分別是GABARAPL2、MAP1LC3B、BECN1、ATG10、GABARAP、ATG12、GABARAPL1、ATG3、MAP1LC3A和ATG5，其作用主要作为维A酸诱导基因I/黑色素瘤分化相关抗原5（retinoic acidinducible gene i/melanoma differentiationassociated gene 5，RIGI/MDA5）信号通路的负调节因子发挥作用（P<0.05），见图5和图6。
3 论近年来，舌鳞状细胞癌的发生发展和临床治疗越来越引起学者们的关注。尽管多学科联合综合序列治疗逐渐在临床中开展，如手术治疗联合术后放化疗、靶向治疗、免疫疗法等。但TSCC因其自身的浸润性强、易转移、易复发等特点，手术切除肿物及淋巴结清扫术后患者生存率仍然偏低。探究TSCC的潜在分子机制，寻找有效的作用靶点对TSCC的治疗具有重要意义。
自噬是在进化过程中高度保守的、广泛存在于真核细胞内的一种溶酶体依赖性的降解途径。自噬作为一种Ⅱ型程序性细胞死亡方式，与自噬相关蛋白一起在癌症发生中起着至关重要的作用。抑制自噬能够增强抗癌治疗的效果，在肿瘤治疗中针对自噬抑制与其他抗癌治疗方法结合具有巨大潜在价值[4～5]。目前发现，自噬可以促进免疫细胞向癌床移动，其元件与恶性潜能相关，并且预示着口腔鳞状细胞癌的不良预后[6]。表明调节TSCC的自噬是一种潜在的治疗策略。
FIP200、ATG7作为自噬相关基因在多种肿瘤中通过参与自噬调节发挥着重要作用。例如在ATG7与肿瘤的相关研究[7～10]表明，与正常组织相比，ATG7在人肺癌组织中过表达。而在肝细胞癌中，LncRNA通过海绵化MiR181a5p调节ATG7表达从而促进自噬。此外，ATG7失活可以降低患者大肠癌癌前病变的风险，敲除ATG7可以抑制致癌物诱导的致癌炎症微环境，从而抑制肿瘤的发生[11]。这些研究都显示了ATG7在肿瘤中的重要作用。本实验使用免疫组化法证实ATG7在癌组织中的表达高于癌旁正常组织，这提示我们自噬活性在TSCC中可能得到增强，进一步的分析显示ATG7在TSCC的中低分化标本的表达水平高于高分化标本，提示ATG7在TSCC中参与自噬并与TSCC的恶性程度有着密不可分的关系。既往研究显示，FIP200介导的典型自噬是支持肿瘤细胞生长所必需的，在肿瘤发生的过程中起到关键作用[12]。本实验证明了FIP200在癌组织中过表达。已有研究表明，FIP200过表达可促进自噬，从而促进肿瘤的发生和发展。不仅如此，在转移癌中，FIP200蛋白表达水平高于原发癌[13]，且在随后治疗后复发的转移灶中其水平也升高，原发性乳腺癌中较高的FIP200 mRNA水平与较差的无病生存期显著相关。我们的研究结果与目前已有的研究都显示了FIP200在肿瘤中促进肿瘤发生发展的重要作用，但其具体机制仍有待进一步实验证明。
为了进一步探究ATG7与FIP200在TSCC中的潜在作用机制，本实验使用在线生物信息学分析工具 STRING分别分析了与ATG7及FIP200相互作用最为密切的10个蛋白。了解与之特异性结合的这10个伴侣蛋白质可较全面描述ATG7与FIP200的功能。随后使用FunRich软件分别对ATG7与FIP200进行基因富集分析，通过分析表明FIP200参与了细胞中ULK1ATG13FIP200复合体以及自噬小体组成，进一步证明FIP200是参与自噬发生的关键因子，这与GANLEY等人[14]的研究结论一致。过往研究表明，RIGI/MDA5信号通路参与抑制结肠癌、胶质母细胞瘤、胃腺癌等多种肿瘤的发生过程[15～17]，而我们的生物信息学分析和基因富集综合分析发现，ATG7作为RIGI/MDA5信号通路的负调节因子，表明ATG7可能作为癌基因促进肿瘤的发生发展。这与本研究中ATG7作为癌基因在TSCC中高表达并与肿瘤分化程度相关的结论基本一致，也提示我们今后可以从RIGI/MDA5信号通路对ATG7的影响方面进行研究。
综上所述，FIP200、ATG7 在TSCC组织中呈高表达，且ATG7与TSCC的恶性程度呈正相关关系，与患者肿瘤的组织学分级呈负相关关系，进一步的基因富集分析说明这两者是与自噬相关的关键基因，这些发现为TSCC自噬相关的发病机制的研究提供理论基础，为FIP200、ATG7作为肿瘤标志物成为TSCC的临床治疗靶点提供了一定的研究依据。
参 考 文 献
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（收稿日期：2020-11-04 修回日期：2021-04-22）
（編辑：梁明佩）
