基于碘刻蚀金银纳米立方块利用暗场显微镜高灵敏检测脑透析液中碘
刘佳 李巧君 王超 李凯 林雨青
摘?要?采用局域表面等离子体共振（LSPR）技术研究了金银纳米立方块（[email protected] NCs）与I2的反应过程，以[email protected] NCs为探针，在暗场显微镜（DFM）下分析探针与不同浓度I/I2作用后的颜色比和散射光强度，发现探针颜色由蓝色逐渐变为黄绿色，同时其散射光强度不断下降。此外，通过透射电镜（TEM）和紫外?可见（UV?Vis）吸收光谱发现，[email protected] NCs从边缘不断被氧化刻蚀，逐渐变成球形， 最终变成类球形。以[email protected] NCs作为探针检测I2，利用DFM检测I2的线性范围为0.1～50 μmol/L，检出限为17 nmol/L，并将本方法应用于鼠脑透析液中I2的加标检测，探究了[email protected] NCs与I/I2之间的氧化还原反应过程。本研究为鼠脑透析液中I2的加标回收提供了一种新的高灵敏方法。
关键词?金银纳米立方块; 暗场显微镜; 散射强度; 碘
1?引 言
碘（I）是人体必须的微量元素之一，70%～80%的碘存在于甲状腺中，是甲状腺激素的重要组成部分。碘对大脑和神经系统的发育非常重要，在人体所需的营养中，对智力影响最为显著的是碘元素，缺碘可能会造成小儿大脑发育异常，甚至不可恢复的智力残疾。近年，化学催化、分析测定等领域与碘相关的研究报道较多[1～3]。有研究者发现，碘对金属纳米颗粒的形貌和形态控制有重要影响[4]，碘会通过吸附在纳米颗粒的表面，降低纳米颗粒的表面电势， 诱导纳米颗粒聚集[5～8]; 碘对纳米颗粒的合成也有很好的调控作用， 如可诱导合成金三角 [9，10]; 有研究者利用碘对金纳米颗粒腐蚀后仍然具有很好的生物相容性的性质，在金纳米颗粒进入细胞之前先用碘腐蚀，可避免信号的干扰，并且还可达到对生物组织无伤害的效果[11]。尽管之前对碘的研究已经有很多，但主要碘元素与金纳米颗粒或银纳米颗粒的相互作用[12～16]， 对于碘与金银纳米方块的研究很少，对活体脑中碘的检测研究尚少。
近年来，贵金属纳米颗粒由于其小尺寸效应、表面效应、量子尺寸效应及其所具有的高度活跃的外层电子，具备独特的光学性质， 局域表面等离子体共振（LSPR），受到广泛关注。因为它们有很强的散射光，现已经被广泛用于生物传感和生物成像[17，18]、催化[19]、癌症治疗[20，21]和表面增强拉曼散射（SERS）等领域。当被特定频率的入射辐射光激发时，金属纳米粒表面的自由电子发生集体振荡，这导致其独特的散射和吸收光学现象[22～25]。LSPR特征强烈依赖于纳米粒子的材料、 形状、 大小、 周围的介电环境及粒子间的耦合作用[26～29]。与单金属纳米颗粒相比，核壳结构的双金属因为其结构的独特性和尺寸易控性，近年备受关注。通过将不同贵金属材料复合，可体现多种贵金属材料的优势，同时也可通过金属纳米粒子之间的电磁耦合，调节纳米粒子的局域表面等离子体共振特性。
本研究采用两步法获得金种子，用种子生长法合成金银纳米立方块（[email protected] NCs）。由于等离子体在Au和Ag表面的良好耦合，[email protected] NCs具有更好的散射效率和吸收波长范围; 合成的[email protected] NCs有利于改善Ag NCs较差的水溶性，同时还能保持Ag NCs的高灵敏度[30，31]。利用暗场显微镜（DFM）成像技术对[email protected] NCs的LSPR信号变化进行监测，观测了I2腐蚀[email protected] NCs的过程，如图1所示。实验结果表明，随着碘的加入，探针散射光的强度不断下降，同时散射光的颜色由蓝色变为黄绿色。 紫外?可见吸收技术以及TEM等表征结果证明， [email protected] NCs与I/I2之间的反应是从顶点被蚀刻并逐渐转变为球形，最终变为类球形。由于[email protected] NCs的形态发生了明显的变化，导致了其LSPR性质的变化。最后以[email protected] NCs为探针，利用DMF可在0.1～50 μmol/L线性检测I2，并成功用于鼠脑透析液中加标检测I2。本研究为I2的检测提供了一种新技术，有望在相关生物检测研究中得到应用。
2?实验部分
2.1?仪器与试剂
UV?2550紫外?可见分光光度计（日本岛津公司）。 JEM?2100F透射电子显微镜（日本捷欧路公司）。 尼康 80i光学显微镜（日本尼康公司），油浸暗场聚光器（数值孔径1.20～1.43），60× Plan Fluor物镜，TGBS（每毫米70个槽，Edmund Optics）组成，一台CoolSNAP HQ2 CCD相机（最佳光谱响应窗口为470～630 nm，量子效率为460%，Roper Scientific）和一台Olympus DP72彩色CCD相机。
十六烷基三甲基溴化铵（CTAB，>98.0%）、十六烷基三甲基氯化铵（CTAC，>98.0%）、氯金酸（HAuCl4·3H2O）、 L?抗壞血酸（BioUltra，≥99.5%）、AgNO3（>99%）和 NaBH4（99%）购自Sigma?Aldrich公司。KI、 I2、NaOH、柠檬酸钠和其它化学品购自北京化学试剂公司。所有试剂均未经过纯化，直接使用。实验用水为Milli?Q系统（美国Millipore公司）生产的超纯水（18.2 MΩ·cm）。以王水清洗所有玻璃器皿，用水彻底冲洗，并在使用前干燥。
2.2?[email protected]核壳纳米立方块制备
2.2.1?金种子溶液的制备?采用两步法制备[email protected]核壳纳米立方体[32]。首先向含有HAuCl4（0.25 mmol/L）和CTAB（100 mmol/L）的10 mL溶液中加入0.6 mL冰冷的NaBH4溶液（10 mmol/L），溶液颜色变为褐色，制备直径为3 nm 的金纳米种子溶液。将种子溶液在27°C孵育3 h，以确保NaBH4完全分解并留在溶液中。
2.2.2?CTAC封端的金种子的制备?将6 mL HAuCl4溶液（0.5 mmol/L）、6 mL CTAC溶液（200 mmol/L）和4.5 mL AA溶液（100 mmol/L）混合，然后加入0.3 mL 3 nm金种子溶液。最终混合物在1 min内从无色变为红色，表明形成较大的金纳米晶体。静置1 h， 14500 r/min离心 30 min，收集产物，用水洗涤1次，记录UV光谱。将纳米晶体分散在4 mL去离子水中，使得种子溶液中金的浓度约为0.146 g/L。
2.2.3?[email protected]纳米立方块的制备?将0.5 mL CTAC 封端的金种子溶液和4.5 mL CTAC （20 mmol/L）溶液混合在20 mL烧瓶中。将混合物在磁力搅拌下60℃加热20 min，同时注入特定体积的AgNO3溶液（2 mmol/L）、 AA溶液（50 mmol/L）和CTAC（40 mmol/L）， 注射泵的速度为0.2 mL/min。加入反应溶液中的AA（50 mmol/L）体积保持与AgNO3相同，均为0.5 mL。注射后，最终溶液中AgNO3的浓度为0.17 mmol/L。在注射期间，反应混合物从红色变为棕黄色。继续反应4 h后，所得到的材料用冰浴淬灭， 14500 r/min离心15 min， 收集产物，然后用水洗涤1次。
3?结果讨论
3.1?金银纳米颗粒合成过程的形貌和吸收光谱表征
采用种子生长法获得[email protected] NCs。利用NaBH4还原HAuCl4合成金纳米晶[32]，TEM图像如图2A所示。球形金纳米晶约为3 nm; 在HAuCl4、AA和CTAC存在下，3 nm的金纳米晶生长成11 nm的金纳米晶（图2B）。图2C为[email protected] NCs的TEM图像，颗粒大小约为（46.7±2.3） nm，其中粒径在40.0～47.5 nm之间的[email protected] NCs约占90%（图2C插图），这与～50 nm颗粒具有优异的LSPR效应是一致的[33]。图2 D为3 nm金纳米晶（曲线1）、11 nm金纳米晶（曲线2）和[email protected] NCs（曲线3）的紫外?可见吸收光谱，3 nm金纳米晶体的吸收峰为293 nm，与文献[32]结果相符。吸收峰相对较窄，说明其粒径相对均匀，TEM结果也证实了这一点。此外，合成的11 nm金纳米晶的吸收峰为512 nm。[email protected] NCs的吸收峰值在451 nm处，这与Ag壳层的形成有关，Ag壳屏蔽效应导致峰值位置发生蓝移。以上结果初步证实本实验成功制备了[email protected] NCs。
3.2?[email protected] NCs的HRTEM形貌表征
对制备的材料进行了高分辨透射电镜表征。在[email protected] NCs高分辨透射电镜图（图3A）中可见到明显的核壳结构。用X射线能谱元素像分析技术（EDS?mapping）表征了[email protected] NCs表面的元素组成，用蓝色标记Au存在的区域 （图3B），用红色标记Ag存在的区域 （图3C）。从图3D可见，合成的[email protected] NCs有明显的核壳结构， 并且表面存在的金元素和银元素分布均匀。从图3E可清楚地观察到所合成纳米颗粒表面银的晶格，晶格对应为面心立方Ag （200） 晶面，表示成功制备了金银核壳纳米立方结构。同时，对[email protected] NCs的X射线能谱数据进行了分析（图3F）。 结合前面的分析可知，本研究成功制备了[email protected] NCs。
3.3?[email protected] NCs与不同浓度I/I2的相互作用的暗场光散射成像
[email protected] NCs与I/I2反应后，LSPR散射光发生变化，导致暗场颜色发生变化。[email protected] NCs与不同浓度的I/I2反应后， 暗场颜色的变化如图4所示，有大面积暗场散射，合成的[email protected] NCs为蓝色，因为Ag壳层较厚，阻挡了Au的光散射信号。由于纳米粒子散射光的颜色与纳米粒子的大小有关，因此这进一步表明合成的纳米粒子大小均匀。图4B～4F为添加不同浓度I/I2后[email protected] NCs大面积暗场散射图像（0、0.1、0.5、1、10和50 μmol/L）。 加入I/I2溶液后，[email protected] NCs在暗场中的散射光先变为亮黄色，然后逐渐变暗，说明I2与Ag壳层发生反应。AgI改变了探针表面的物理化学性质，所以散射光的颜色发生了变化。但随着I/I2浓度的进一步增加，[email protected] NCs进一步被腐蚀，AgI不断沉积在[email protected] NCs表面，导致散射光强度减弱，散射光颜色也不断发生变化。这为探索[email protected] NCs与I/I2的反应过程提供了一种更直观、更快、更简单的新方法。
光学成像技术已被广泛运用于多个领域，如在细胞或组织水平上可视化和确定生物结构[17]。目前，研究者已提出了几种描述各向异性纳米粒子的光学性质的数值方法，包括离散偶极子近似法，时域有限差分法、有限元法和多重多极法[34～39]。使用这些数值方法模拟各向异性纳米颗粒的光学响应通常非常复杂和耗时。即使对于简单的各向异性纳米结构，如椭球状纳米棒，也不能直接揭示光学性质对其形状的依赖性。所以，本研究采用颜色比例法分析[email protected] NCs纳米颗粒的光学响应信号，B表示蓝色，G表示绿色， Y表示黄色。如图4G所示，随着I/I2浓度增加，蓝色占比逐渐下降，黄色占比逐渐上升，綠色变化比较平缓。进一步分析得到黄光颜色占比I/I2浓度之间的关系（图4I），其线性关系如图4J所示，得到检测范围为0.1～50.0 μmol/L，线性方程为y=4.47x+42.56 （R2=0.972）， 检出限达到17 nmol/L。上述结果进一步证明[email protected] NCs被刻蚀的程度与I/I2浓度有关。
在对颜色进行分析的同时，本研究还对光信号强度进行了分析。 随机选取3张I/I2浓度的暗场原图片，在每张图中随机选取约100个粒子，利用Image J提取其散射光强度信息，再分别计算，统计出其散射光强度的变化值。如图4H所示，随着I/I2浓度增加，其散射光强度先增加后逐渐降低，原因可能是先加入少量的I/I2， [email protected] NCs的大小未发生明显变化，而表面被氧化形成AgI外壳，颗粒折射率发生变化，所以散射光强度先增加;然而，随着I/I2的浓度逐渐增大，[email protected] NCs逐渐被氧化刻蚀，粒径减小，散射光强度逐渐降低。当加入I/I2浓度超过10 μmol/L时，散射光强度几乎不再发生变化。这可能是因为Ag壳表面的活性位点有限，导致反应无法进一步进行。
3.4?[email protected] NCs纳米颗粒与I/I2的反应前后TEM表征研究了[email protected] NCs与I/I2相互作用的暗场成像特性。为进一步探讨[email protected] NCs与I/I2之间的相互作用，采用TEM对合成的纳米粒子进行表征。如图5所示，在添加I/I2前，Ag壳相对较厚，Au核相对较小，因此，在上述暗场成像中，[email protected] NCs的散射光呈蓝色。加入I/I2后，[email protected] NCs的散射光由蓝色逐渐变为黄绿色，与纳米粒子的形貌变化相对应。[email protected] NCs的形貌变化从立方体的各个角逐渐圆滑，最终变成球形，再进一步与I/I2反应，形貌最终变成类球形。从图5A～5C可见，随着I/I2对银壳层的不断腐蚀，[email protected] NCs的尺寸略有增加，这是因为I2被还原成AgI沉淀，并沉积在纳米颗粒上。此外，随着I/I2浓度增加，在不断被刻蚀的过程中，[email protected] NCs形状不断变化，最终形成类球形，这可能由于I2与Ag壳层过度反应形成AgI，从而导致其与Au核分离[40]。
3.5?[email protected] NCs纳米颗粒与I/I2作用后TEM表征对刻蚀后的[email protected] NCs进行了高分辨透射元素表征和EDS?mapping表征（图6）。本研究用绿色标记Ag元素存在的区域 （图6B），用黄色标记Au元素存在的区域 （图6C），用红色标记I元素存在的区域 （图6D）。从图6E可见，合成的纳米颗粒保留有明显的核壳结构，并可很清楚地看到I元素覆盖在Ag壳表面， 表明合成的[email protected] NCs颗粒被I/I2氧化刻蚀。由图6F可知反应后Au、Ag的含量。结合前面的分析，可得出[email protected] NCs颗粒逐渐被I/I2氧化刻蚀，从TEM图可清楚地看出氧化刻蚀位置是从[email protected] NCs颗粒的顶点开始氧化，逐渐刻蚀为球形，对应在暗场的表现为散射光强度逐渐降低，散射颜色由蓝色变为黄绿色。
3.6?[email protected] NCs与I/I2的相互作用紫外光谱分析
图7是[email protected] NCs与不同浓度的I/I2反应的紫外可见光谱和照片。随着I/I2浓度增加，颜色由亮黄色变为灰色，说明I/I2与探针材料发生了反应。此外，峰位由450 nm逐渐红移至600 nm。众所周知，蓝光的吸收波长约为450～435 nm，绿光的吸收波长范围约为577～ 492 nm，黄光的吸收波长范围约为597～577 nm。紫外?可见光谱显示，[email protected] NCs与I/I2反应后，散射光由蓝色逐渐变为黄绿色，与上述暗场数据完全吻合。红移的原因可能是[email protected] NCs在加入I/I2后发生团聚。
3.7?实际样品中碘浓度的检测
为了考察[email protected] NCs检测实际脑透析液中I2的可行性，在鼠脑透析液中添加I2进行测试。在鼠脑透析液中加入[email protected] NCs，其紫外?可見吸收光谱未发生红移，说明鼠脑透析液中未检出I2。在鼠脑透析液中加入不同浓度的I/I2（0.5、1、2、5和10 μmol/L），结合UV?Vis确定I/I2在鼠脑透析液中的回收率（表1）。本研究设计的[email protected] NCs探针灵敏度高，可用于鼠脑透析液中I2的加标检测。
4?结 论
采用局域表面等离子体共振（LSPR）技术研究了[email protected] NCs与I/I2的反应过程。探针与不同浓度I/I2作用后，颗粒散射光的颜色和强度发生了变化，可得到相应的I2检测定量信息，检出限为17 nmol/L。DFM和TEM结果证实了散射光与[email protected] NCs形貌之间的关系，证实了等离子体共振散射峰移动与[email protected] NCs形貌变化之间的关系。结合反应前后[email protected] NCs的形貌、紫外?可见光谱和表面元素分析，得到了Ag壳层与I/I2溶液反应后形成了[email protected]纳米粒子。本研究揭示了[email protected] NCs与I/I2相互作用过程，有助于研究Au和Ag纳米粒子的氧化腐蚀过程， 并将此氧化还原反应成功应用于鼠脑透析液中I2的加标检测。
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