突触传递逆行性信号分子的实时电化学监测

    张芙莉　邱权发　杨小柯　黄卫华

    

    

    

    摘?要?神经系统是人体重要的指挥系统，神经细胞之间的信息交流主要依赖于突触前分泌的神经递质等顺行性信号分子以及突触后释放的逆行性信号分子。一氧化氮（NO）是一种重要的逆行性信号分子，能够调节突触强度和突触可塑性以适应不同的生理需求。然而， 目前鲜有逆行性信号分子释放检测的报道。为了实现突触后释放逆行性信号分子NO的实时监测，本研究在碳纤维电极表面修饰铂纳米颗粒，构建了一种具有高时空分辨率、高灵敏度、响应快速的超微电化学传感器。首先采用L?精氨酸和谷氨酸刺激海马神经元，证明了海马神经元合成NO以及细胞膜上N?甲基?D?天冬氨酸受体结合谷氨酸后释放NO的能力。在此基础上，利用高钾溶液刺激突触前神经元胞体模拟神经冲动，诱导突触前释放神经递质谷氨酸，成功检测到突触后神经元产生的NO信号。本研究结果直接证实了突触传递过程伴随着逆行性信号分子释放，建立的方法为研究神经系统反馈调节和突触可塑性机制提供了有力的工具。

    关键词?海马神经元; 突触传递; 逆行性信号分子; 一氧化氮; 电化学检测

    1?引 言

    神经系统是人体的最高指挥系统，调控机体的各项生理活动，神经细胞之间的信号转导是神经系统发挥其功能的基础。因此，研究神经信号转导的分子机制，对于探索大脑的功能、理解神经退行性疾病的致病机理以及开发相应的疗法具有重要意义。

    在神经系统中，细胞之间的信息传递主要依靠突触结构完成，突触是一种神经元细胞膜高度异化的结构，包括突触前结构、突触间隙和突触后结构三个部分[1，2]。当突触受到外界影响或自身环境变化时，突触的结构和传递性能也会随之改变，这一现象被称为突触可塑性。突触可塑性的实现依赖于突触前与突触后之间的信息交流，其中突触前的正向信号传递主要由神经递质等顺行性信号分子完成，突触后向突触前传递信号则依赖于逆行性信号分子[3，4]。逆行性信号分子是指由突触后细胞生成或者由突触活动诱发，并作用于突触前神经元，调节突触强度、神经兴奋性以及信号传递的分子。根据其自身性质，逆行性信号分子可以分为三类：膜结合型分子、外分泌因子和膜渗透性分子。其中， 膜渗透性分子以一氧化氮（NO）为主，可以通过扩散作用经过突触后细胞膜和突触间隙直接进入突触前末梢。如在海馬神经元中，突触前膜释放的神经递质谷氨酸与突触后膜上的N?甲基?D?天冬氨酸（NMDA）受体结合[5]，引起Ca2+内流，在钙调蛋白的作用下，一氧化氮合酶（NOS）被激活，催化底物L?精氨酸生成NO，生成的NO扩散至突触前末梢，调节突触强度[4，6]。在神经科学领域，科研人员主要利用转基因、细胞药理学、电生理等手段研究NO的反馈调节作用，并且取得了显著进展，逐步揭示了NO的作用通路以及生理效应[7～9]。但是，目前还鲜有直接检测突触后逆行性信号分子NO释放的报道。

    用于直接检测NO的方法很多[10]，如化学发光法[11]、荧光法[12]、电子顺磁共振技术[13]、电化学方法[14～17]等。由于生物体内NO含量低，且极不稳定，衰减速率快，所以要求检测方法具有很高的时空分辨率和优良的检测性能。超微电化学方法具有检测灵敏度高、时空分辨率高、仪器简单的优点[14，17～20]，非常适用于单细胞水平NO的实时动态监测。

    本研究构建了高灵敏的超微电化学传感器，用于单个神经元以及突触后NO释放的实时监测。首先利用L?精氨酸和谷氨酸刺激海马神经元，证明体外培养的海马神经元具备合成和释放NO的能力。在此基础上，使用高钾溶液刺激突触前神经元胞体模拟神经信号传递过程，成功检测到突触后神经元释放的逆行性信号分子NO（图1）， 为神经系统突触可塑性中NO的生理功能研究提供了新方法。

    2?实验部分

    2.1?仪器与试剂

    KQ3200DA超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）; Synergy?UV超纯水机（电阻率大于18 MΩ·cm， 法国默克密理愽）; CHI660A电化学工作站（上海辰华有限公司）; SW?CJ?1FD超净工作台（苏净集团安泰空气技术有限公司）; GI54DWS高压灭菌器（致微仪器公司）; Hera cell 150二氧化碳恒温细胞培养箱（美国赛默飞世尔公司）; Zeiss SIGMA扫描电子显微镜（德国蔡司公司）; P?2000激光拉制仪（美国Sutter Instrument Company）; MF?200抛光仪显微镜（美国World Precision Instruments Inc）; 手动微操作手（手动三轴微操，江苏瑞明生物科技有限公司）; LSP04?1A注射泵（保定兰格恒流泵有限公司）; EPC?10膜片钳电流放大器（德国HEKA公司）; TransferMan NK2电动微操作手（德国艾本德公司）; AxioObserver Z1倒置光学显微镜（德国蔡司公司）。

    碳纤维（直径5～7 μm， 英国Goodfellow Cambridge Limited公司）; 导电碳胶（利用石墨粉与奥斯邦环氧灌封胶150T?A组分手动调制而成，使用时加入少量150T?B混合即可固化）; AB胶（改性聚丙烯酸酯）; 1B100?4和1B100F?4玻璃毛细管（美国World Precision Instruments， InC）; 新生SD大鼠（湖北省实验动物研究中心，具备实验动物使用许可证）; 氯铂酸（H2PtCl6·6H2O，上海试剂一厂）; 谷氨酸（Glutamate， Glu）、羟乙基哌嗪乙硫磺酸（HEPES）、胰蛋白酶、基础培养基DMEM?F12和B?27、双抗（青霉素+链霉素）（Amresco公司）; 神经生长因子（NGF）、聚赖氨酸（PLL）、层粘连蛋白（Laminin）、L?精氨酸（L?Arg）、L?NAME、Hemin（美国西格玛公司）。其余试剂均购买于国药集团; 所用试剂，如未特殊说明均为分析纯，且未经进一步纯化直接使用。

    2.2?实验方法

    2.2.1?碳纤维微米电极的制备?利用导电碳胶将长度为1～2 cm的碳纤维与铜丝粘结，并依次将碳纤维浸入无水乙醇和超纯水中超声清洗，晾干。从拉制仪拉制的尖端口径为5～7 μm的玻璃毛细管尾部穿入碳纤维?铜丝，并伸出毛细管尖端约50 μm，将玻璃管尖端靠近酒精灯火焰，熔融封口。再将裸露的碳纤维撞击玻璃平面形成尖端碳纤维长度约5 μm的微柱电极。最后采用AB胶密封玻璃管和铜丝连接处。

    2.2.2?微电极电化学性能的表征?采用循环伏安法（CV）进行电极表征，电化学实验采用两电极体系：微电极为工作电极， Ag/AgCl电极为参比电极和对电极，1 mmol/L铁氰化钾为电化学探针。循环伏安检测均在CHI660A电化学工作站上进行。

    2.2.3?微电极的修饰?利用电化学还原法在微电极表面修饰铂纳米颗粒，采用两电极体系：微电极作为工作电极，Ag/AgCl电极为参比电极和对电极，镀铂溶液为1 mmol/L氯铂酸，0.2 mmol/L硫酸钠。电沉积电位范围为0.1 V～0.6 V，沉积电量为0.1 μC。并采用循环伏安法和恒电位计时电流法，表征铂纳米颗粒修饰的碳纤维微米电极检测NO的能力。

    2.2.4?神经细胞的获得与培养?实验所用原代海马神经元取自新生SD大鼠海马组织。具体步骤如下：取出新生幼鼠脑部，找出月牙状的海马体，沿着海马区边缘将海马组织取出。将上述取出的海马组织转移至装有0.125%胰酶消化液的培养皿，放入37℃细胞培养箱消化。3 min后，加入无血清培养基终止消化，并用移液枪反复吹打制成细胞悬浮液。将上述细胞悬浮液接种于预先用0.02% PLL和10 μg/mLlaminin孵育过的玻片上，然后在37℃、5% CO2环境下培养于无血清培养基中。

    2.2.5?细胞实验?将细胞培养基移除，洗净，换为细胞外液。利用倒置显微镜明场成像观察细胞，寻找海马神经元之间的突触连接。预先用激光拉制仪制备尖端约为10 μm的毛细加样管，灌入相应的刺激溶液，连接注射泵用于刺激细胞。利用微操作手分别将微电极和加样管移动至细胞附近。加样管距离刺激细胞約50 μm，电极尖端靠近待测细胞，在显微镜40倍物镜下可以观察到电极与细胞膜接触，并使细胞膜轻微变形。采用安培法监测信号，电压设置为700 mV，利用膜片钳放大器对信号进行放大，并使用软件“Pluse”进行数据采集（采集频率设置为1 kHz）。为减小噪音，上述操作均在法拉第笼中进行，并且相关仪器都已接地。

    3?结果与讨论

    3.1??碳纤维微米电极的制备与表征

    参考本课题组之前发展的方法[20]， 采用火焰熔融玻璃毛细管密封碳纤维，制备了碳纤维微米电极（Carbon fiber microelectrodes， CFMEs），电极尖端直径约为3～5 μm，长度控制在5 μm左右（图2A）。 此电极具有优良的电化学性能，充电电流小（图2B），且不同批次制备的电极具有良好的重现性和稳定性（图2C）。

    3.2?碳纤维微米电极的修饰和表征

    为了增强电极对NO的响应性能， 采用电化学还原的方法在CFMEs表面沉积铂纳米颗粒。扫描电镜结果（图3A）表明，沉积的铂纳米颗粒尺寸约为50～100 nm，且分布均匀，无明显团聚现象。利用循环伏安法考察铂纳米颗粒修饰的碳纤维微米电极（Pt/CFME）对NO的电化学检测性能。与CFME相比，Pt/CFME对NO的响应显著增强，当电压达到0.5 V时可以观察到明显的电化学氧化电流，并在0.65 V处达到峰值（图3B）。上述结果表明， 铂纳米颗粒被成功修饰在碳纤维电极表面，且对NO有良好的电化学检测能力。

    为了考察Pt/CFMEs对NO的定量检测能力， 测量了电极对不同浓度NO的安培响应。结果如图3C所示，电极对不同浓度的NO响应迅速，信号稳定，在9～180 μmol/L浓度范围内对NO具有良好的线性响应（R2=0.9829），电极灵敏度为66 nA L/mmol，检出限为0.37 μmol/L。

    3.3?L?精氨酸刺激海马神经元释放NO

    细胞内的NO主要由NOS催化氧化L?精氨酸合成。为了验证实验中培养的原代海马神经元合成和释放NO的能力， 使用L?精氨酸溶液刺激单个海马神经元，并对其释放的信号进行检测。

    如图4A所示，向正常海马神经元加入L?精氨酸刺激液后，迅速检测到电流上升信号（如曲线a所示，从起始上升到达到峰值耗时仅数十毫秒）。这是由于较高浓度的L?精氨酸进入细胞，被胞内的NOS迅速氧化生成NO，脂溶性的NO穿过细胞膜，扩散到神经细胞外，被电极检测。为了验证实验中的电流信号来自NO，加入NOS的抑制剂（L?NAME）作为对照实验，结果显示， 该条件下使用L?精氨酸刺激液无明显的安培信号产生（曲线b）。由此， 可以确认实验中培养的海马神经元具备合成和分泌NO的功能，且释放的NO能被Pt/CFME顺利检测。

    3.4?谷氨酸刺激海马神经元释放NO

    为了模拟突触传递中突触前细胞胞吐释放谷氨酸调控突触后细胞的过程，直接利用谷氨酸溶液刺激海马神经元，考察海马神经元细胞膜上的NMDA受体被谷氨酸激活后是否引起NO释放。如图4B所示，当海马神经元受到谷氨酸刺激后，产生明显的安培响应信号，维持数秒钟后逐渐减弱（曲线a）。为了验证这一信号的来源，进行了如下两组对照实验。首先，加入NOS抑制剂 L?NAME，使用谷氨酸刺激神经细胞时，无明显安培信号产生（数据未给出）。此外， 在检测体系中加入NO的清除剂血红素（Hemin），谷氨酸刺激海马神经元时也无明显安培信号产生（曲线b）。上述结果表明， 实验中采集到的安培信号来源于海马神经元释放的NO，即NMDA受体被谷氨酸激活后可促使NO的合成与释放。

    3.5?高钾溶液刺激海马神经元突触释放NO

    为了考察突觸传递过程中是否会释放逆行性信号分子NO， 使用高钾溶液刺激突触前海马神经元胞体[20]（刺激毛细管在图中未显示），产生的神经冲动沿轴突传递（图中红色虚线箭头），到达轴突终端后引发谷氨酸胞吐释放（图中蓝色箭头所指处），将Pt/CFME置于突触后膜处（图中黑色箭头所指处），对突触后细胞释放的信号进行实时监测（图4C）。如图4D所示，实验中有明显的安培信号出现，说明在真实的突触传递过程中，突触后细胞会合成和释放NO。前文中提到，反馈信使NO的生成路径涉及到谷氨酸胞吐释放以及突触后膜上的NMDA受体激活等过程，因此，采用镉离子抑制突触前谷氨酸释放（曲线b）或采用NMDA 受体拮抗剂美金刚[21]（曲线c）孵育细胞，抑制突触传递过程。结果表明， 两种情况下均无信号产生，进一步表明神经元在进行突触信息传递时伴随着逆行性信号分子NO释放过程。相比于谷氨酸直接刺激海马神经元产生的信号，高钾溶液刺激突触前细胞引起突触后细胞产生的NO信号明显变小，且持续时间缩短。可能原因是高浓度谷氨酸过度激活NMDA受体产生神经毒性[22]，从而释放大量NO[5]，且目前已有研究表明NO参与谷氨酸介导的神经兴奋性毒性，而在正常突触传递过程中，逆行性信号分子则会维持在一个合理水平。

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    Real?time Electrochemical Detection of

    Retrograde Messengers in Synaptic Transmission

    ZHANG Fu?Li， QIU Quan?Fa， YANG Xiao?Ke， HUANG Wei?Hua*

    （College of Chemistry and Molecular Sciences， Wuhan University， Wuhan 430072， China）

    Abstract?Nervous system is a significant command system， and the communication between neurons depends on anterograde messengers such as neurotransmitters released from presynaptic neurons and retrograde messengers from postsynaptic cells. As an important kind of retrograde messengers， nitric oxide can regulate synaptic strength for different physiological needs. Whereas， most current researches focus on presynaptic exocytosis of neurotransmitters but ignore the detection of retrograde messengers. To monitor retrograde messenger nitric oxide released from postsynaptic neurons， we developed an electrochemical sensor with rapid response， high sensitivity and spatio?temporal resolution by modifying platinum nanoparticles on carbon fiber microelectrodes. The ability of hippocampal neurons to synthesize and secrete nitric oxide was firstly evidenced by successful detection of nitric oxide released from L?arginine??or glutamate?stimulated neurons. On this basis， the neuronal transmission was initiated by stimulating presynaptic neuron with high potassium solution， and the nitric oxide released from postsynaptic neurons was monitored in real time. The results demonstrated that synaptic transmission was accompanied with the release of retrograde messengers. This method

    has promising potential in exploring synaptic feedback regulation and plasticity in nervous system.

    Keywords?Hippocampal neurons; Synaptic transmission; Retrograde messengers; Nitric oxide; Electrochemical detection