维生素K3对光老化HaCaT细胞保护作用的研究

    韩伊杨 魏志平 杜佳溪 陈娇

    

    

    

    [摘要]目的:探讨维生素K3对UVA辐照下角质形成细胞的光保护作用及相关机制。方法:以5J/cm2的UVA辐照HaCaT细胞建立光老化细胞模型。采用不同浓度(0、0.125μM、0.25μM、0.5μM)的维生素K3预处理HaCaT细胞24h;CCK-8方法检测细胞增殖活性;活性氧(ROS)检测荧光探针2',7'-二氯荧光黄双乙酸盐(DCFH-DA)检测细胞内活性氧水平;Western blot法检测各组细胞MMP1、COX2、LC3B蛋白的表达。结果:与单纯光照组相比,维生素K3能够促进光老化HaCaT细胞的体外增殖,且呈浓度依赖性,差异有统计学意义(P<0.05);药物干预组HaCaT细胞的ROS含量降低,差异有统计学意义(P<0.05);细胞内MMP1、COX2蛋白表達降低,LC3B表达增高,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:维生素K3能够对UVA辐照HaCaT细胞提供光保护作用,其机制可能与促进细胞自噬有关。

    [关键词]HaCaT细胞;光老化;紫外线A;维生素K3;自噬

    [中图分类号]R339.3+8? ? [文献标志码]A? ? [文章编号]1008-6455(2020)12-0102-04

    Protective Effect of Vitamin K3 on Photoaged HaCaT Cells

    HAN Yi-yang1,WEI Zhi-ping2,DU Jia-xi1,CHEN Jiao1

    (1.Graduate School of Xuzhou Medical University,Xuzhou 221002,Jiangsu,China;2.Department of Dermatology,Affiliated Hospital of Xuzhou Medical University,Xuzhou 221002,Jiangsu,China)

    Abstract: Objective? To explore the photoprotective effect of Vit K3 on keratinocytes under UVA irradiation and related mechanisms. Methods? HaCaT cells were irradiated with 5J/cm2 of UVA to establish a photoaging cell model. HaCaT cells were pretreated with Vit K3 at different concentrations (0, 0.125μM, 0.25μM, 0.5μM) for 24h. Proliferation of cells was detected by CCK-8 method. Reactive oxygen species (ROS) detection fluorescent probe 2',7'-dichlorofluorescein yellow diacetate (DCFH-DA) was used to detect intracellular reactive oxygen level. The expression of MMP1, COX2 and LC3B was detected by Western blot. Results? Compared with the light-only group, Vit K3 could promote the proliferation of HaCaT cells in a concentration dependent manner, the difference was statistically significant (P<0.05). The ROS content of HaCaT cells in the drug intervention group was lower (P<0.05). The expression of MMP1 and COX2 protein was decreased, and the expression of LC3B was increased (P<0.05). Conclusion? Vit K3 could provide photoprotection to HaCaT cells irradiated by UVA, and its mechanism might be related to promoting autophagy.

    Key words: HaCaT cells; photoaging; Ultraviolet A; Vitamin K3; autophagy

    光老化被认为是紫外线辐射损伤在皮肤老化基础上的叠加,作为一种退变过程而引起人们的广泛关注[1],尤其是A型长波紫外线(UVA),UVA过度辐照将导致皮肤红斑生成、ROS异常表达、MMPs、COX-2等生成并导致炎症发生,推动光老化[2]。自噬与衰老密切相关,具有许多共同的特征,在衰老机制的研究中发现,细胞自噬能够延缓器官功能退化,这表明两者在细胞中可能发挥相似的功能和作用[3]。随着研究的进展,许多证据提示:自噬,同样可能与有机生物体内最大的器官-皮肤组织的老化密切相关。研究证实,自噬可以通过清除UV辐照细胞内受损的蛋白质和脂质,修复DNA,帮助细胞恢复代谢稳态,为光老化受损的皮肤提供保护作用[4]。适度的自噬有助于抑制紫外线损伤皮肤角质形成细胞,维持正常的细胞自噬水平有助于抵抗UVA所致的光老化[5]。维生素K3(Vit K3)是一种合成的类似Vit K的物质,作为维生素原在体内转化为活性形式。最近一些研究表明,Vit K3具有诱导细胞自噬的功能[6]。鉴于此,本实验以人永生化角质形成细胞(HaCaT细胞)作为体外UVA辐照光老化细胞的模型,旨在初步探索Vit K3对UVA辐照下角质形成细胞的生物学作用,以期进一步为光老化治疗的研究提供理论依据和新的思路。

    自噬的失調可导致多种皮肤病的发生并导致皮肤衰老[7]。一项角质形成细胞中的体外研究发现,自噬诱导可增强角质形成细胞中核因子E2相关因子2依赖性的抗氧化反应[8]。而Atg7基因(自噬相关基因7)灭活小鼠的体内研究中也显示,在缺乏自噬的情况下,细胞将表现出DNA损伤、细胞周期阻滞和脂质表型紊乱等典型的早衰[9]。以上研究均提示,从细胞自噬的角度来了解衰老皮肤的特征,发现与应用自噬调节药物,对于治疗和预防紫外线所致的皮肤疾病具有重要意义[10]。而近年来关于维生素K3的促自噬效应受到了广泛的关注。为了阐明维生素K3自噬功能与光老化的关系,本实验以体外UVA损伤的HaCaT细胞为光老化模型,进行实验,首先观察了紫外线辐射对角质形成细胞形态及生理活性的影响,其次检测光老化细胞中相关蛋白标记物的表达,继而探讨维生素K3对光老化模型中HaCaT细胞的作用。

    在现有的机制学说认为,UVA辐射通过上调角质形成细胞中基质金属蛋白酶1(MMP-1)的表达,诱导破坏细胞外包括胶原蛋白在内的基质蛋白,从而导致皮肤结构完整性受损[11]。而环氧化酶-2(COX-2)是一种诱导产生前列腺素的酶,该酶在上表皮高表达,受光、生长因子和细胞因子的调控[12]。UVA辐射将导致细胞内COX-2表达上调,诱导角质形成细胞增殖、表皮增生、炎症和水肿,加速光老化的进展。在本实验中,分别检测了上述光老化损伤的标志性生物分子的表达。结果发现,与单纯UVA照射组比较,Vit K3药物干预组这些标记物的表达得到抑制。该结果证实了本次假设,即Vit K3可以减轻UVA诱导的光损伤。

    UV已报导可通过下调细胞中抗紫外线相关基因(UVRAG)和p53的表达导致自噬溶酶体功能障碍[13]。微管相关蛋白3(LC3)是一种可溶性蛋白,在哺乳动物组织和培养细胞中广泛表达,与自噬相关,反映了自噬活性[14]。为了探究UVA诱导的HaCaT细胞光老化与自噬的联系,进行了蛋白免疫印迹实验。结果表明,Vit K3的加入在一定程度上恢复了受抑制的LC3-Ⅱ蛋白表达。由此,可以推测UVA诱导HaCaT细胞光老化及Vit K3作用的可能通路:UVA辐射抑制了HaCaT细胞内自噬水平,使得自噬介导的细胞自我清除由UVA诱导产生的ROS、COX-2和MMP-1等因子的能力下降,上述因子在细胞内发生异常积聚;而皮肤组织在这些因子的作用下,出现胶原纤维的合成减少、降解增多,炎症反应增多,皮肤组织结构失去完整性,最终叠加在内源性老化基础上,推动皮肤粗糙、干燥、血丝增多等光老化进程[15]。

    综上所述,笔者认为Vit K3不仅可以逆转UVA照射引起的细胞活力下降,还可以抑制光化细胞中的COX-2,MMP1的生成。重要的是,发现UVA可以抑制自噬,减少LC3-Ⅱ的形成,而Vit K3由于其自噬诱导特性可以抑制这种作用。结果表明,Vit K3可以通过自噬激活有效地保护HaCaT细胞不受光老化的影响,为Vit K3对抗皮肤光老化的机理提供了可能的理论依据,以及为Vit K3可能进一步开发为抗光老化药物提供了理论基础。

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    [收稿日期]2020-07-07

    本文引用格式:韩伊杨,魏志平,杜佳溪,等.维生素K3对光老化HaCaT细胞保护作用的研究[J].中國美容医学,2020,29(12):102-105.