AngⅡ对血管平滑肌细胞ANO1表达的影响及机制

    迟晓琦 李浩然 吴雪 张文秀 韩晓华

    

    [摘要]目的 探讨血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）对大鼠血管平滑肌细胞（VSMCs）钙激活氯通道ANO1蛋白表达的影响及其受体机制。方法 用不同浓度（1、10、100、500、1 000 nmol/L）AngⅡ处理VSMCs 24 h或用100 nmol/L AngⅡ處理VSMCs不同时间（1、6、12、24、48 h），观察AngⅡ对ANO1表达的影响。AngⅡ处理（100 nmol/L，24 h）前分别加入血管紧张素Ⅰ型受体（AT1R）阻断剂氯沙坦钾（LP）和血管紧张素Ⅱ型受体（AT2R）阻断剂PD123319（PD），进一步探讨AngⅡ作用的受体机制。以组织贴块法进行大鼠VSMCs的原代培养，采用Western blot法检测ANO1蛋白表达水平。结果 与对照组相比，以10～1 000 nmol/L AngⅡ处理24 h可明显提高细胞中ANO1蛋白表达水平，其中以100 nmol/L AngⅡ的作用最为显著（F=18.56，P<0.01）;与对照组相比较，以100 nmol/L AngⅡ处理12～48 h可显著上调细胞中ANO1蛋白的表达（F=10.84，P<0.01）。AT1R阻断剂LP可完全阻断AngⅡ诱导的ANO1表达（F=9.68，P<0.05），而AT2R阻断剂PD无此作用。结论 AngⅡ以浓度和时间依赖性的方式显著上调VSMCs中ANO1蛋白的表达，该作用是通过AngⅡ与AT1R结合而实现的。

    [关键词]血管紧张素Ⅱ;肌细胞，平滑肌;氯化物通道;ANO1;受体，血管紧张素;大鼠

    [中图分类号]R329.25;R544

    [文献标志码]A

    [文章编号]2096-5532（2021）02-0214-04

    [ABSTRACT]Objective To investigate the effect of angiotensin Ⅱ （AngⅡ） on the expression of anoctamin 1 （ANO1） in rat vascular smooth muscle cells （VSMCs） and its receptor mechanism.?Methods VSMCs were treated with different concentrations of AngⅡ （1， 10， 100， 500， and 1 000 nmol/L） for 24 h or were treated with 100 nmol/L AngⅡ for different durations （1， 6， 12， 24， and 48 h）， and the effect of AngⅡ on the expression of ANO1 was observed. The angiotensin Ⅱ type 1 receptor （AT1R） antagonist losartan potassium （LP） or the angiotensin Ⅱ type 2 receptor （AT2R） antagonist PD123319 （PD） was added before the treatment with 100 nmol/L AngⅡ for 24 h to further explore the receptor mechanism of AngⅡ. The tissue patch me-thod was used for the primary culture of rat VSMCs， and Western blot was used to measure the protein expression level of ANO1.Results Compared with the control group， the cells treated with 10-1 000 nmol/L AngⅡ for 24 h showed a significant increase in the protein expression level of ANO1， and 100 nmol/L AngⅡ showed the most significant effect （F=18.56，P<0.01）. Compared with the control group， the cells treated with 100 nmol/L AngⅡ for 12-48 h had a significant increase in the protein expression of ANO1 （F=10.84，P<0.01）. The AT1R antagonist LP completely blocked the expression of ANO1 induced by AngⅡ （F=9.68，P<0.05）， while the AT2R antagonist PD had no such effect.?Conclusion AngⅡ significantly upregulates the protein expression of ANO1 in VSMCs in a concentration- and time-dependent manner， possibly by binding to AT1R.

    [KEY WORDS]angiotensin Ⅱ; myocytes， smooth muscle; chloride channels; ANO1; receptors， angiotensin; rats

    高血压是一种以血压持续升高为主要临床表现的心血管疾病，具有很高的发病率和致残率[1-3]。长期的高血压会导致血管结构和功能的改变，即血管重构[4]，而后者是导致高血压重要靶器官（如心、脑、肾等）损伤的关键病理生理学基础[5]。肾素-血管紧张素系统（RAS）对心血管功能具有重要的调节作用[6]。血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）是RAS的主要活性成分，可以通过诱导血管收缩和外周血管阻力增加

    升高血压;此外，AngⅡ对血管平滑肌细胞（VSMCs）具有重要的调节作用，可通过促进VSMCs的增殖、迁移和血管外基质分泌等作用，促进血管重构的发生[7-8]。在自发性高血压大鼠（SHR）血浆和心血管组织中AngⅡ水平明显升高，提示AngⅡ可能是促进高血压形成和发展的重要因素[9]。

    ANO1是2008年发现的钙激活氯通道，在心血管系统中有广泛的表达[10-11]。ANO1参与血管舒缩功能的调节已有较多报道[12-14]，这可能是由于ANO1激活导致VSMCs内Cl-外流和膜除极，进而激活细胞膜电压依从性钙通道，触发胞外钙内流和血管收缩，但是ANO1和血管重构的关系报道较少。有研究发现，ANO1参与了肾型高血压大鼠大脑中动脉血管重构的形成[15]; ANO1能通过血管重构促进肺动脉高压（PH）的形成[16];在野百合碱和低氧诱导的大鼠PH模型中，ANO1被证实是肺动脉VSMCs的钙激活氯通道，且高表达的ANO1通过促进血管收缩和血管重构参与PH的形成[14]。WANG等[17]的研究结果表明，ANO1在SHR的血管组织和VSMCs中均呈高表达，并参与了SHR高血压的形成，但是诱导ANO1高表达的因素并未被阐明。根据前期研究，我们推测AngⅡ可能通过促进VSMCs的ANO1蛋白表达，参与对VSMCs功能调控。因此，本实验利用原代培养的大鼠胸主动脉VSMCs，观察AngⅡ上调ANO1表达的量-效和时-效关系，并进一步探讨AngⅡ作用的受体机制。

    1 材料与方法

    1.1 试剂与仪器

    AngⅡ、血管紧张素Ⅰ型受体（AT1R）阻断剂氯沙坦钾（LP）和血管紧张素Ⅱ型受体（AT2R）阻断剂PD123319（PD）由ApexBio公司提供，ANO1抗体购自Abcam公司，β-actin抗体购自北京博奥森公司，DMEM高糖培养粉购自Gibco公司，胎牛血清购自美国BI公司，BCA蛋白检测试剂盒购自Thermo公司，RIPA裂解液由碧云天生物科技研究所提供，其他试剂均为国产分析纯。实验仪器包括CO2培养箱、无菌超净工作台、Eppendorf高速离心机、SpectraMax M5多功能酶标仪、微量分析天平以及Western显影仪等。

    1.2 VSMCs的原代培养

    实验选用体质量80～100 g的Wistar大鼠，采用组织贴块法进行VSMCs的原代培养[18-20]。大鼠以80 g/L水合氯醛（400 mg/kg）腹腔注射麻醉后，用体积分数0.75的乙醇消毒，迅速剥离胸主动脉，转移到提前加入培养液的预冷玻璃皿中，清理血管内的血液及血管外筋膜，轻轻刮去内皮，将血管条剪成约1 mm3的小块，铺于培养瓶底部，加入含体积分数0.20胎牛血清的DMEM培养液4 mL，垂直放入CO2培养箱中，静置4～5 h后翻瓶，培养约1周后VSMCs在血管块周围长出，选5～8代细胞进行后续实验。

    1.3 实验分组

    实验1将VSMCs分为对照组（加入无血清培养液处理）和AngⅡ组（分别加入1、10、100、500、1 000 nmol/L AngⅡ），处理24 h后观察AngⅡ对ANO1蛋白表达的影响。实验2分为对照组（加无血清培养液）和AngⅡ组（加入100 nmol/L AngⅡ），观察AngⅡ作用不同时间（1、6、12、24、48 h）对ANO1蛋白表达的影响。实验3分为对照组（加无血清培养液）、AngⅡ组（加100 nmol/L AngⅡ作用24 h）、AngⅡ+LP组（AngⅡ处理前加入1 μmol/L LP）、AngⅡ+PD组（AngⅡ处理前加入1 μmol/L PD），观察AngⅡ受体阻断剂对ANO1蛋白表达的影响。

    1.4 Western blot检测

    药物处理结束后以RIPA裂解液提取蛋白，用BCA法检测蛋白浓度。样品均以20 μg蛋白上样，经SDS-PAGE电泳后转移至PVDF膜上，加100 g/L脱脂奶粉在室温下摇床慢摇封闭60～120 min，分别加入ANO1（1∶1 000）和β-actin（1∶10 000）一抗，在4 ℃摇床上孵育过夜。用TBST洗膜3次后，加入二抗，在室温下摇床慢摇孵育1 h，TBST再洗膜3次后，用ECL发光液显影。用Image J软件分析条带的灰度值，结果以ANO1/β-actin比值表示。实验重复3～4次，取平均值。

    1.5 统计学分析

    应用GraphPad Prism 5.0软件进行统计学处理。结果以x2±s表示，多组均数比较采用单因素方差分析（one-way analysis of variance， ANOVA），继以Tukeys多重对比法进行两两比较。以P<0.05认为差异有统计学意义。

    2 结 果

    2.1 不同浓度AngⅡ对ANO1蛋白表达的影响

    对照组ANO1蛋白表达水平为0.78±0.02，以1、10、100、500、1 000 nmol/L AngⅡ处理细胞24 h后，ANO1蛋白表达水平分别升高至0.85±0.05、0.92±0.03、1.14±0.10、0.95±0.02和0.91±0.02（n=3，F=18.56，P<0.01）。在各浓度组中，以10、100和500 nmol/L AngⅡ组的改变具有统计学意义（q=4.866～12.820，P<0.01），且以100 nmol/LAngⅡ作用最為显著（图1）。

    2.2 AngⅡ作用不同时间对ANO1蛋白表达影响

    对照组ANO1蛋白表达水平为1.00±0.09，以100 nmol/L AngⅡ处理1、6、12、24、48 h后，ANO1蛋白表达水平分别升高至1.05±0.17、1.28±0.30、1.65±0.28、1.82±0.14和1.58±0.12（n=4，F=10.84，P<0.01），其中AngⅡ作用12、24和48 h后，ANO1蛋白的表达显著增加（q=5.661～8.053，P<0.01）。见图2。后续实验选用100 nmol/L的AngⅡ处理24 h进行观察。

    2.3 AngⅡ受體阻断剂对AngⅡ诱导的ANO1蛋白表达的影响

    对照组、AngⅡ组、AngⅡ+LP组和AngⅡ+PD组细胞蛋白表达水平分别为1.00±0.19、1.45±0.14、0.95±0.16和1.41±0.06（n=3，F=9.68，P<0.05）。与对照组相比，AngⅡ组ANO1蛋白表达水平升高（q=5.313，P<0.05）;与AngⅡ组相比，AngⅡ+LP组ANO1蛋白表达降低至对照组水平（q=5.872，P0.05）。结果提示AT1R阻断剂LP能够完全阻断AngⅡ诱导的ANO1蛋白表达，而AT2R阻断剂PD则无此作用。见图3。

    3 讨 论

    AngⅡ是RAS的主要活性物质[21]，也是公认的诱导高血压发生发展的关键致病因素。系统或血管局部生成的AngⅡ，不仅可以通过诱导血管平滑肌收缩和外周阻力增加升高血压，还可以通过刺激VSMCs异常增殖、迁移和细胞外基质形成，促进高血压血管重构的发生发展[8，22]。AngⅡ主要通过结合AT1R或AT2R发挥作用[23]。AngⅡ与AT1R结合后，可激活磷脂酶C（PLC）/三磷酸肌醇（IP3）信号通路，通过肌质网内钙释放，导致胞内钙水平升高，AngⅡ也可以激活AKT、ERK、RhoA/ROCK信号途径以及升高胞内活性氧（ROS）等多条途径，参与对VSMCs的功能调控[24]。AngⅡ对AT2R的亲和力较低，一般认为AngⅡ与AT2R结合可拮抗其与AT1R结合所产生的效应[25]。

    ANO1是血管平滑肌上的钙激活氯通道[26]，可参与血管功能和血压的调节，并且和高血压的血管重构密切相关。一项针对SHR的研究表明，ANO1在血管组织和原代培养的VSMCs中均高表达，并且参与了SHR高血压的形成[17]。由于SHR血循环和血管组织局部RAS过度激活已有报道[9]，且WSTEN-VAN ASPEREN等[27]研究发现，AngⅡ能够增强ANO1依赖性钙激活氯电流，因此我们推测AngⅡ很可能促进了VSMCs中的ANO1蛋白表达，进而参与AngⅡ对VSMCs的功能调控。

    本研究首先利用组织贴块法进行VSMCs的原代培养，然后通过将不同浓度AngⅡ加入VSMCs作用不同时间，观察AngⅡ对ANO1蛋白表达的影响。研究结果显示，AngⅡ能够明显促进VSMCs的ANO1表达，并且呈明显的剂量和时间依赖性。而通过利用特异性的血管紧张素受体阻断剂，本研究进一步明确了AngⅡ上调ANO1的作用是通过与AT1R结合而实现的。钙激活氯通道ANO1是心血管领域的一个新的研究热点，本研究通过探讨AngⅡ对VSMCs中ANO1表达的影响及受体机制，为进一步明确ANO1可能参与AngⅡ诱导的VSMCs功能异常提供了前期的实验依据。目前，临床上对高血压血管重构的预防和治疗效果并不理想，而对ANO1的深入研究，可能为高血压血管重构的防治提供新的思路。

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    （本文編辑 马伟平）