柔性一体化电化学传感器检测汗液的pH值及尿酸浓度

    周靓 崔媛 赫春香

    

    

    

    摘?要?分别以木犀草素和L-精氨酸作为pH值和尿酸（Uric acid，UA）的功能选择性试剂，与碳粉混合，掺杂在聚氯乙烯（PVC）成膜液内，制成pH柔性薄膜电极（pH flexible electrode，pH/FE）和尿酸柔性薄膜电极（UA flexible electrode，UA/FE）。将pH/FE、UA/FE、自制薄膜凝胶型Ag/AgCl参比电极、Pt丝电极平放在塑料薄膜上，用含有饱和KCl的聚乙烯醇-琼脂膜包埋四电极，露出工作电极表面，构成贴敷式柔性一体化电化学传感器（Flexible integrated electrochemical sensor，FIES）。连接pH/FE，将pH 2.00～8.00的磷酸盐缓冲溶液（PBS）分别滴涂在FIES表面，结果表明，在方波伏安曲线上出现一个氧化峰，峰电位与pH值呈线性关系。将含有UA的PBS滴涂在FIES表面，连接UA/FE，采用方波伏安法研究了UA的电化学行为，氧化峰电流与UA浓度在5.0×10?6～1.3×10?4 mol/L范围内呈线性关系，检出限为2.0×10?7 mol/L。将FIES贴敷于皮肤表面上，可直接测定汗液的pH值和UA浓度。

    关键词?pH柔性电极;尿酸柔性电极;一体化;电化学传感器;贴敷式

    1?引 言

    可穿戴式传感器以非入侵式、小型化、低成本等优势，近年来得到极大关注[1～5]，这类设备多集中于物理或电生理学参数的监测，如呼吸率、血氧含量、皮肤温度、身体运动、大脑活动和血压等[6～11]。可穿戴化学传感器通过对生物液体（如汗液[12～20]、眼泪[21～27]、唾液[28]等）的非入侵式监测，对佩戴者的体能和伤病状况进行评估。采用可穿戴光化学传感器已经建立了pH 2.00～11.0 范围内的pH值[15，19]、NH+4[12，13]、乳酸[29]、Fe3+和Hg2+[30]以及葡萄糖[21，23，26]的测定方法，其中，电化学传感器因其高性能、便携性、简单性和低成本等优势占据主导地位[37]。

    电化学可穿戴传感器的导电薄膜基质主要有两大类：柔性塑料类高聚物薄膜和纺织类纤维[4];参比电极均为薄膜型Ag/AgCl;柔性薄膜型工作电极包括电导型[18]、电位型[12，32，33]和安培型传感器[12，17]。电导型传感器受选择性局限，主要用于体液电解质总量的监测。采用电位型可穿戴电化学传感器已经实现了pH 4.0～7.0 范围内的pH值[32]、Na+、K+和葡萄糖的测定[12，16，20，22]。安培型传感器应用范围更广。Gao等[12]将乳酸氧化酶或者葡萄糖氧化酶修饰于覆盖了普鲁士蓝的金膜表面，Kim[28]、Jian[14]、Yao[24]等分别将乳酸氧化酶、葡萄糖氧化酶滴注到被普鲁士蓝、碳油墨修饰的聚对苯二甲酸乙二醇酯基体电极上，构成柔性乳酸和葡萄糖传感器。Kim等[17]用铋/Nafion修饰碳墨水柔性电极制成可穿戴临时纹身传感器，用方波阳极溶出伏安法测定了汗液中的Zn2+浓度。Mishra等[34]在碳油墨印刷无纺布基质上点涂Nafion/OPH酶，制成柔性可伸缩手套，用方波伏安法检测了食品中有机磷的浓度。Windmiller等[35]介绍了能同时测定2，4，6-三硝基甲苯、抗坏血酸、尿酸的“电子皮肤”，但未见传感器制作方法的详细报道。

    可穿戴传感器可实时、在体测定，与常规测定方法的区别之一是不宜优化介质条件，而某些测定对象，如抗坏血酸和尿酸等，其电信号与酸度条件密切相关，部分报道仍需借助缓冲溶液调节最佳测定条件。本研究以pH值和尿酸（Uric acid，UA）为测定模型物，设计了对pH值和UA有选择性响应的柔性薄膜电极（pH flexible electrode，pH/FE;UA flexible electrode，UA/FE），以及包埋了四电极的柔性一体化电化学传感器（Flexible integrated electrochemical sensor，FIES），将其直接贴敷于皮肤表面汗液处，可以测定汗液的pH值和UA濃度，建立了受试者体液酸度不同时UA检测信号的校正方法，提高了检测结果的准确度。

    2?实验部分

    2.1?仪器与试剂

    LK205A微机电化学分析系统（天津市兰力科化学电子高技术有限公司）;pHS-3C型数字酸度计（上海雷磁仪器厂）。

    木犀草素（纯度98%，西安天本生物工程有限公司）;L-精氨酸（纯度98%，上海康达氨基酸厂）;UA（纯度99%，上海化学试剂采购站）;pH 2.00～8.00的系列磷酸盐缓冲溶液（PBS），由浓度均为0.2 mol/L的H3PO4、KH2PO4、Na2HPO4、Na3PO4混合而成，采用酸度计测定酸度;光谱纯石墨粉（纯度99%，上海阿拉丁试剂公司）;聚氯乙烯（PVC，纯度99.9%，Fluka公司）;邻苯二甲酸二丁酯（纯度98.5%，国药集团化学试剂公司）。所用试剂均为分析纯，实验用水为石英亚沸二次重蒸水。

    模拟汗液的配制[36]： 含有1.0 g/L尿素、1.0 g/L乳酸、1.0 g/L NaCl、1.0 g/L聚乙烯醇、20 μmol/L UA，用PBS缓冲溶液调至pH 5.0。

    2.2?实验方法

    2.2.1?pH柔性电极的制备?参照本研究组前期工作[37，38]，将0.10 g木犀草素与1.0 g石墨粉充分研磨，混合均匀，待用。在平底玻璃圆筒（φ=40 mm）内，加入3.0 mL四氢呋喃、0.400 g PVC粉，搅拌使PVC完全溶解，加入前述混合物，充分搅拌成悬浊液，再加入30 μL邻苯二甲酸二丁酯，混匀，放置，使四氢呋喃完全挥发，得到柔性电极膜。将膜剪成9.0 mm×30 mm的长方形，厚度约为0.5 mm，在一端插入导线，再用熔融的固体石蜡包埋导线端 10 mm，得到pH/FE。

    2.2.2?UA柔性电极的制备?参照文献[39]的方法，在平底玻璃圆筒内，加入4.0 mL四氢呋喃、0.10 g L-精氨酸，磁力搅拌成悬浊液，然后按2.2.1节的方法加入PVC等组分，成膜，剪裁得到UA/FE。

    2.2.3?薄膜凝胶型Ag/AgCl参比电极的制备

    参照文献[40]?的方法，将0.60 g聚乙烯醇用20 mL热水完全溶解;将0.60 g琼脂粉加到微沸的20 mL饱和KCl溶液中，搅拌使之完全溶解，将两份溶液均匀混合，得到聚乙烯醇-琼脂导电液。将0.25 g AgNO3溶于3.0 mL 热水中，并趁热与20 mL热导电液均匀混合，继续加热，使水分蒸发，得到糊状物，插入Ag丝（Φ=0.5 mm），压成1 mm厚的片状，得到薄膜凝胶型Ag/AgCl参比电极。

    2.2.4?柔性一体化电化学传感器的组装

    将自制pH/FE、UA/FE、Ag/AgCl、Pt丝如图1所示平铺在自制聚四氟乙烯模具内的柔性塑料薄膜上，将适量的2.2.3节制得的热导电液倾倒在模具内，使其在四电极表面形成薄液层，冷却，形成柔性导电凝胶膜（Flexible conductive film，FCF）。用裁纸刀沿两个工作电极的周长轻轻划线，揭去其表面的凝胶，露出工作电极，撤去模具，即得到 FIES（图1）。

    2.2.5?pH值的测定?将 FIES的电极面贴在皮肤汗液处，电化学系统的工作电极接线柱与pH/FE连接，在0.6～1.3 V电位范围内，以0.6 V为起始电位，记录氧化峰电位Epa（方波增量0.01 V，方波幅度为0.05 V，方波频率为20 Hz）。

    2.2.6?UA浓度的测定?将FIES的电极面贴在皮肤汗液处，电化学系统的工作电极接线柱与UA/FE连接，在0～1.0 V 的电压范围内，以0 V为起始电位，等待200 s，然后进行方波扫描（电位增量为0.01 V，方波幅度为0.1 V，方波频率为 20 Hz），记录氧化峰电流。

    3?结果与讨论

    3.1?FIES的设计

    本研究自制了pH 和UA柔性工作电极，以及柔性凝胶型Ag/AgCl参比电极，再与Pt丝对电极匹配，通过共用参比电极和对电极，组成传统电化学方法中的两套三电极系统。不采用经典电化学方法中的支持电解质和电解池，而是用含有饱和KCl的柔性聚乙烯醇-琼脂薄膜型导电凝胶将四电极联通在一起，构成了贴敷型FIES。

    3.2?FIES对 pH值的响应

    将 pH 2.00～8.00 范围的PBS分别滴涂在FIES表面，记录方波伏安曲线，曲线上均出现一个氧化峰，归属于pH/FE中的木犀草素[37]，其峰电位随pH值的增大而负移（图2A），并呈良好的线性关系（图2B），线性回归方程为Epa（V）=0.0538 pH + 0.637（r=0.999），基于此，可进行pH值的测定。

    3.3?FIES对UA的响应特性

    3.3.1?UA的方波伏安特性?人体新鲜排出的汗液pH值为5.0～6.0，随着水分不断降低，pH值有所下降，维持在4.0～6.0之间[41]，囊性纤维化病人的汗液pH 值可高达9.0[42]。据此，考察了不同浓度的UA在pH 5.00 的PBS中的方波伏安响应。UA呈现一个氧化峰，峰电流随UA浓度的增大而增大（图3A），在5.00×10?6～1.30×10?4 mol/L范围内呈线性关系（图3B），线性回归方程为ipa（μA）=1.21×106c （mol/L）+56.2 （r=0.994），检出限为2.00×10?7 mol/L（3σ）。正常人汗液中的UA浓度约为5.0×10?6 ～3.0×10?5 mol/L[43]，汗液中的UA超出正常范围时，预示体内UA过多，可能会引发痛风等疾病。因此，本方法能够满足检测汗液中UA浓度的一般需求。

    3.3.2?酸度對UA峰电流的影响?UA的电化学氧化峰电流与介质的pH值有关[45]。本研究考察了70 和 90 μmol/L UA在不同pH值时的峰电流，发现在pH 3.50～5.00时，峰电流随pH值的增高而增大;pH 5.00～8.00时，峰电流随pH值增高而减小（图4）;在pH 5.00时，峰电流最大。可穿戴传感器实时在体采集检测信号时，不宜优化介质条件，因此，应考虑不同受试者的汗液酸度差异对UA测定结果的影响。

    3.3.3?pH≠5.0时UA峰电流的校正方法

    由图4可见，在pH 3.50～5.00和pH 5.00～8.00两段范围内，UA的峰电流与pH值分别呈线性关系（线性方程见表1），从pH值与ipa的关系曲线以及线性方程的斜率可知，两组峰电流与pH值的变化规律基本一致，因此，利用斜率的平均值建立了pH≠5.0的峰电流相对于pH=5.0 时的校正方法：当受检者汗液pH5.0时，校正方程为ip （pH 5.0）=ip（实测）+ 17.27 （pH实测-5.0） 。

    3.4?方法的准确度、精密度、重现性和稳定性

    按照实验方法分别测定pH 4.00、pH 6.86的市售标准缓冲溶液的峰电位，每份溶液平行测定5次，实验结果见表2。

    两份溶液测定结果平均值的相对误差（Er）分别是3.2%和2.1%，表明本方法准确度良好，相对标准偏差（RSD）分别为0.3%和0.4%。同法制备5组FIES，检测pH 7.0的PBS，pH值检测结果分别为7.34、7.31、7.31、7.29、7.32，RSD为0.3%，表明此电极的重现性良好。

    采用同一FIES连续5次测定40 μmol/L UA（pH 5.00），得到UA的浓度分别为42.2、39.7、40.5、41.9和39.8 μmol/L，相对误差Er为2.0%，RSD为2.8%，说明此柔性电极稳定性较好。同法制备5组FIES，测定结果（图5）分别为41.8、40.7、39.1、36.2和37.3 μmol/L，Er为2.4%，RSD为5.6%。用同一套FIES装置连续30天测定含80 μmol/L UA，第30天测定结果与第一天的结果仅相差3.4%，说明本方法测定UA具有良好的稳定性。

    3.5?柔性电极的选择性

    考察了Mg2+、Ca2+、Al3+、FeCl3、KNO3、UA作为共存成分对pH值测定的干扰。在pH 5.00 的PBS中分别配制含有1.0×10?3 mol/L 上述组分的溶液，按实验方法测定Epa（图6A）并计算pH值，测定结果的相对误差为0.6%～4.6%（图7A），表明在允许存在±5%相对误差前提下，上述成分均不干扰pH值的测定。

    在pH 5.00的PBS中含有40 μmol/L UA，再分别加入上述无机成分，使共存组分的浓度为1.0 mmol/L，测定UA的峰电流（图6B），发现各共存组分可能改变方波曲线的基线电流，但对峰电流和峰电位影响不大，最大相对误差小于5%，说明上述成分均对UA的测定不产生干扰。

    考虑到汗液、泪液、唾液等生理体液中含有微量脂肪酸、酶、蛋白质等大分子，因此，以0.1%中性表面活性剂聚乙烯醇（PVA）为共存模型物，考察了其对PBS （pH 5.00）和UA测定的影响。结果表明，测定pH值和UA时，峰电流和峰电位几乎不变（图6A和6B），不干扰pH值和UA的测定。

    3.6?汗液中pH值和UA的测定

    将模拟汗液滴在实验者清洗后的胳膊表面，形成薄层汗液，将FIES贴敷于汗液處，连接pH/FE，按实验方法重复测定pH值 5次，测定结果（表2）的平均值为pH 4.94，Er为1.2%，RSD为0.5%。再连接UA/FE，按实验方法测定UA浓度，测定结果（表2）的平均值为19.1 μmol/L，Er为4.5%，RSD为5.8%。

    4?结 论

    制备了pH柔性膜电极和UA柔性膜电极，搭建了柔性一体化电化学传感器，并建立了人体汗液中pH值和UA的测定方法。本研究提供了可穿戴、在体、实时、无创测定体液组分的新型检测装置。更换柔性电极中的修饰剂，可以使其应用于其它化学成分的测定。若能与微型电化学仪器联用，应用范围更广。

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