川芎嗪对支气管上皮细胞ORMDL3表达影响

    丁珍 于菲 万经红

    

    

    

    [摘要]目的 探讨川芎嗪对哮喘易感基因血清类黏蛋白1样蛋白3（ORMDL3）表达的影响。方法 应用IL-4+IL-13刺激人支气管上皮（HBE）细胞ORMDL3过表达，以不同浓度的川芎嗪（200、300、400、500、600、700、800 μg/L）干预72 h，选取干预作用最明显的川芎嗪浓度。以IL-4+IL-13培养的HBE细胞作为模型组，以干预作用最明显的川芎嗪浓度干预IL-4+IL-13培养HBE细胞作为治疗组，PBS培养HBE细胞作为空白组。应用RT-PCR方法分别检测3组ORMDL3 mRNA表達，Western blot方法、免疫组化法检测ORMDL3蛋白表达。结果 400 μg/L浓度的川芎嗪干预作用最明显。治疗组、空白组、模型组ORMDL3 mRNA表达比较差异有显著性（F=176.45，P<0.01），治疗组表达最低。模型组、治疗组ORMDL3蛋白表达较空白组升高，治疗组较模型组降低，差异有统计学意义（F=23.48、91.56，P<0.01）。结论 川芎嗪可通过下调HBE细胞ORMDL3基因表达，改善哮喘病人气道重塑。

    [关键词]哮喘;血清类黏蛋白;川芎嗪

    [中图分类号]R287.5

    [文献标志码]A

    [文章编号]2096-5532（2021）02-0276-04

    [ABSTRACT]Objective To investigate the effect of ligustrazine on the expression of the asthma susceptibility gene orosomucoid 1-like protein 3 （ORMDL3） in serum. ?Methods Human bronchial epithelial cells （HBECs） were stimulated by interleukin-4 （IL-4） and interleukin-13 （IL-13） to induce the overexpression of ORMDL3， and ligustrazine at different concentrations （200， 300， 400， 500， 600， 700， and 800 μg/L） was used for intervention for 72 h to screen out the concentration of ligustrazine with the most significant intervention effect. HBECs cultured with IL-4+IL-13 were selected as model group; HBECs cultured with ligustrazine at the concentration with the most significant intervention effect were selected as treatment group; HBECs cultured with phosphate-buffered saline were selected as blank group. RT-PCR was used to measure the mRNA expression of ORMDL3， and Western blot and immunohistochemistry were used to measure the protein expression of ORMDL3. ?Results Ligustrazine at the concentration of 400 μg/L had the most significant intervention effect. There was a significant difference in the mRNA expression of ORMDL3 between the treatment group， the blank group， and the model group （F=176.45，P<0.01）， and the treatment group had the lowest expression of ORMDL3. The model group and the treatment group had significantly higher protein expression of ORMDL3 than the blank group， and the treatment group had significantly lower expression than the model group （F=23.48，91.56;P<0.01）. ?Conclusion Ligustrazine can improve airway remodeling in asthmatic patients by downregulating ORMDL3 gene expression in HBECs.

    [KEY WORDS]asthma; orosomucoid; tetramethylpyrazine

    支气管哮喘（简称哮喘）是以慢性气道炎症和气道高反应性为特征的异质性疾病。哮喘慢性气道炎症最终导致气道的持续性损伤而致气道结构异常，即气道重塑。气道重塑是哮喘的重要病理特征，显著影响哮喘的预后。哮喘的发生发展与遗传因素和环境因素有关，其中哮喘易感基因发挥重要作用。血清类黏蛋白1样蛋白3（ORMDL3）基因是一种哮喘关联基因，与哮喘气道重塑的发生、发展密切相关[1]。吸入布地奈德可以减少ORMDL3表达，并减轻气道重塑的严重程度，二者有明显相关性[2]。然而，长期大剂量使用糖皮质激素会产生较大副作用，诱发或加重感染，抑制机体的免疫功能 [3-4]。川芎嗪为中药川芎主要有效成分，是一种应用广泛的中药活性成分，临床用于治疗冠状动脉疾病、缺血性脑血管疾病以及肿瘤等[5]。有研究表明，川芎嗪具有多种生物活性，如抗氧化活性、对多种肿瘤细胞的细胞毒性、抑制血管平滑肌细胞增殖、预防内皮细胞损伤等[6]，川芎嗪还能抑制成纤维细胞合成胶原纤维[7]。还有研究显示，川芎嗪有影响哮喘病人气道重塑的能力[8]。然而其作用机制尚未阐明。本研究旨在观察川芎嗪对ORMDL3表达影响，为早期防治哮喘气道重塑提供实验依据。

    1 材料和方法

    1.1 实验材料

    人支气管上皮（HBE）细胞（上海博古生物科技有限公司，CBNumber：CB35771380）;南美胎牛血清（FBS，维森特生物技术有限公司）;Trizol （上海普飞公司）;四甲基吡嗪（美国Sigma公司）;Primer、二甲基亚砜（DMSO）、MTT（上海吉凯基因医学科技股份有限公司）;RNase Inhibitor （Promega公司）;SYBR Master Mixture（TAKARA）;oligo dT （生工生物工程（上海）有限公司）。

    1.2 研究方法

    1.2.1 细胞培养 HBE细胞加入RPMI-1640培养液（含体积分数0.10的FBS，10 000 kU/L青霉素、10 g/L链霉素）中，置于培养箱（37 ℃，含体积分数0.05 CO2）中培养，隔天换液，倒置显微镜下观察细胞生长情况，待细胞长至80%表面面积时传代。

    1.2.2 药物作用时间选择 取对数生长期HBE细胞接种于 96 孔板，每孔加入 1×104 个细胞，应用含有体积分数0.10 FBS的RPMI-1640培养液，在37 ℃、含体积分数0.05 CO2、饱和湿度条件下培养24 h。另设空白组、对照组（加入相应体积的PBS）。每组设 6个平行复孔。分别培养24、48、72 h后，加入MTT溶液，培养箱孵育4 h。离心去上清后加入DMSO溶液，酶标仪检测570 nm 波长处吸光度（A）值。计算细胞存活率。细胞存活细胞率（%）=（实验组A值/对照组A值）×100%。

    1.2.3 川芎嗪浓度选择及实验分组 以100 μg/L的IL-4+IL-13培养的HBE细胞为模型组，分别加入不同浓度的川芎嗪（200、300、400、500、600、700、800 μg/L）作用72 h，观察川芎嗪对IL-4+IL-13诱导HBE细胞ORMDL3 mRNA干预作用。以作用最明显的川芎嗪浓度作为实验浓度，将实验浓度的川芎嗪加入100 μg/L IL-4+IL-13培养HBE细胞作为治疗组，以100 μg/L IL-4+IL-13培养HBE细胞为模型组，以PBS培养HBE细胞作为空白组。3组培养时间均为72 h。

    1.3 检测指标及方法

    1.3.1 RT-PCR方法检测ORMDL3 mRNA表达

    取各组培养后的HBE细胞，采用Trizol法提取mRNA，按照RT-PCR试剂盒说明书将mRNA反转录成cDNA，使用RT-PCR方法检测ORMDL3 mRNA表达。所用引物及其序列見表1。反应体系20 μL，内含：反转录产物5 μL，上下游引物共5 μL，SYBR Green 10 μL。以GAPDH为内参照。反应条件为：95 ℃，预变性30 s，1个循环;95 ℃、5 s，60 ℃、30 s，40个循环;95 ℃、5 s，60 ℃、30 s，95 ℃、5～10 min，1个循环。

    1.3.2 Western blot方法检测ORMDL3蛋白表达

    取培养后的各组细胞，加入200 μg/L的RIPA裂解液，在冰上裂解30 min，4 ℃、12 000 r/min离心30 min。取上清液，行SDS-PAGE凝胶电泳，然后电转移至PVDF膜上，加入50 g/L脱脂奶粉，室温封闭2 h。加入兔抗人ORMDL3抗体（1∶200稀释），4 ℃冰箱过夜，室温下TBST洗膜3次，加入1∶5 000稀释的羊抗兔二抗，常温孵育2 h;TBST室温下洗膜3次，光化学法显影，用Image J软件扫描各条带灰度值，以β-action（1∶200稀释）为内参照，以各条带灰度值/内参照灰度值表示ORMDL3蛋白表达。

    1.3.3 免疫组化检测ORMDL3蛋白表达 取各组细胞，制作细胞爬片。血清封闭，PBS漂洗，向切片上分别滴加ORMDL3抗体（Abcam107639，1∶200稀释）孵育过夜，PBS漂洗，二抗孵育，DAB显色。光学显微镜下观察，细胞棕色着色为ORMDL3蛋白阳性表达。应用Image J软件计算ORMDL3蛋白相对表达量。

    1.4 统计学处理

    应用SPSS 19.0软件进行统计学分析。符合正态分布的计量资料结果用x2±s表示。数据间比较先进行方差齐性检验，方差齐则进行方差分析， 若方差不齐则进行Welchs分析。

    2 结 果

    2.1 不同培养时间细胞存活率及不同药物浓度组ORMDL3 mRNA表达比较

    培养24、48、72 h细胞存活率分别为（90.13±1.96）%、（94.51±1.91）%、（97.22±1.91）%，各时间比较差异有显著性（n=6，F=20.60，P<0.05），培养72 h细胞存活率最高。后续实验以72 h为药物培养时间。200、300、400、500、600、700、800 μg/L浓度的川芎嗪作用HBE细胞72 h，其ORMDL3 mRNA表达分别为2.472±0.178、0.763±0.058、0.823±0.142、0.994±0.059、0.978±0.038、1.084±0.079、0.947±0.036，各组比较差异有显著性（n=6，F=5.34，P<0.05）。400 μg/L川芎嗪对IL-4+IL-13诱导HBE细胞血清ORMDL3 mRNA表达的干预作用最明显。后续实验以400 μg/L为川芎嗪药物浓度。

    2.2 各组ORMDL3 mRNA表达比较

    空白组、模型组、治疗组ORMDL3 mRNA表达分别为0.947±0.036、1.000±0.0371、0.763±0.058，各组ORMDL3 mRNA比较差异有显著性（n=6，F=176.45，P<0.01）。

    2.3 各组ORMDL3蛋白表达比较

    Western blot及免疫组化检测结果均显示，模型组、治疗组ORMDL3蛋白表达较空白组升高，治疗组较模型组降低，差异有统计学意义（F=23.48、91.56，P<0.01）。见表2和图1、2。

    3 讨 论

    哮喘病因为痰、虚、瘀，痰瘀互结是哮喘发作期的主要病机，治疗应以治痰活血并重。《读医随笔》云：“痰为血类，停痰与瘀血同治。”唐容川《血证论》说：“须知痰水之壅，由瘀血使然，但去瘀血则痰水自消。”哮喘的病机是“内有壅塞之气，外有非时之感，膈有胶固之痰。”临床研究发现，对于哮喘发作期及缓解期的寒哮、热哮证，川芎都有显著的疗效[9]。哮喘病儿久病正气不足，伏痰内生，气虚血瘀，故痰瘀互结是哮喘的主要病因病机。血瘀证贯穿于哮喘的始终。《本草纲目》有云：“川芎者，血中之气药。”川芎辛温香燥，走而不守，既能行散，上达巅顶;又入血分，下行可达血海，为血中之气药，能通达气血，活血祛瘀之功效显著。

    现代医学研究认为，哮喘属于多基因遗传病，由环境因素和遗传因素共同作用而形成。ORMDL3基因位于17号染色体上，包括3个外显子和2个内含子，编码1个位于内质网膜的跨膜蛋白，可以通过调节Ca2+浓度导致未折叠蛋白反应，为哮喘炎性反应发生的内源性诱因[10]。哮喘的一个重要的病理特点是气道重塑。气道重塑可发生于成人及儿童哮喘病人，而ORMDL3基因高表达的儿童哮喘可能会加速早期气道重塑的进程[11]。既往研究已显示，ORMDL3过表达的转基因小鼠模型可出现气道炎症、气道重塑、气道高反应性和IgE水平升高[12]。

    川芎嗪是川芎生物碱的主要成分之一，在我国被用于改善血液循环及缓解疼痛至少有2 000年的历史。川芎嗪（化学名称四甲基吡嗪）是自中药川芎分离提纯出来的一种酰胺生物碱，是一种钙离子拮抗剂，可影响器官血液流变学参数，有扩张血管、减轻炎症、抗脂质过氧化、抑制钙超载、减轻纤维化、抑制血小板聚集等作用。另外，川芎嗪还有降低气道高反应、改善气道炎症、调节免疫等作用[13-14]。

    研究发现，川芎嗪对过敏性炎症反应和气道重塑具有抑制作用[16-17]。哮喘发病的主要机制是慢性气道炎症，而持续的慢性气道炎症可以引起气道重塑。已有研究表明，HBE细胞在过敏原和细胞因子（IL-4和IL-13）刺激下可诱导ORMDL3表达[15];ORMDL3可通过激活ERK1/2/MMP-9信号通路影响哮喘气道炎症和气道重塑进展[16-18]。本研究应用IL-4+IL-13诱导HBE细胞ORMDL3过表达作为哮喘细胞模型，探讨川芎嗪对气道重塑的影响。结果显示，IL-4、IL-13可诱导HBE细胞ORMDL3 mRNA过表达，400 μg/L浓度川芎嗪作用72 h可顯著降低IL-4+IL-13诱导的HBE细胞ORMDL3 mRNA和蛋白表达，说明川芎嗪可以抑制哮喘气道炎症和气道重塑。其机制可能为：川芎嗪是一种钙离子拮抗剂，可通过调节细胞内Ca2+浓度导致未折叠蛋白反应，从而减轻气道炎症反应，影响气道重塑进程。其具体机制需要进一步的实验证实。

    综上所述，川芎嗪可能通过阻断IL-4+IL-13诱导所致HBE细胞ORMDL3蛋白过表达，在一定程度上改善哮喘气道重塑。本文研究结果为川芎嗪治疗哮喘及其机制研究提供依据。

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    （本文编辑 黄建乡）