补肾解毒方对辐射损伤小鼠重要脏器形态学改变的影响
杨云霜 杜磊 赵雪
摘要 目的：明确补肾解毒方对电离辐射致小鼠重要脏器病理形态损伤的保护作用。方法：60只小鼠，随机分成空白对照组、辐射模型组、中药干预组，中药干预组每天给予补肾解毒方灌胃0.2 mL。其他2组给予等容积生理盐水灌胃，3组均连续灌胃10 d，第11天除空白对照组外，辐射模型组、中药干预组给予一次性5 Gy 60Coγ-射线照射，继续灌胃14 d，辐射后第14天取材，观察小鼠肺、肝脏、脾、空肠的病理形态学改变。结果：电离辐射后14 d，辐射模型组小鼠肺充血，大量炎症细胞浸润;肝窦消失，肝细胞变性、坏死;脾红髓、白髓界限不清;空肠绒毛变短、断裂;而中药干预组小鼠肺、肝、脾、空肠组织结构破坏较轻，更接近空白对照组小鼠。结论：补肾解毒方有较好的防止电离辐射损伤，保护重要脏器的作用。
关键词 补肾解毒方;电离辐射;肺脏组织;肝脏组织;脾脏组织;空肠组织;病理形态;放射性损伤
Abstract Objective：To determine the protective effect of Bushen Jiedu Formula on pathologically damaged vital organs in mice induced by ionizing radiation.Methods：A total of 60 mice were randomly divided into a blank control group，a radiation model group and a traditional Chinese medicine（TCM）intervention group.The TCM intervention group was given 0.2 mL of Bushen Jiedu Formula by gavage every day and the other 2 groups were given equal volume normal saline for gavage.All groups were given continuous gavage for 10 d.On 11 d，except the blank control group，the radiation model group and the TCM intervention group were given one-time 5 Gy 60Coγ-da-ray irradiation，and then the gavage was continued for 14 d.After 14 d，the samples were obtained，whose pathologically morphological changes in lungs，livers，spleens，and jejunum.Results：A total of 14 days after ionizing radiation，the mice in the radiation model group had lung congestion and a large number of inflammatory cells infiltration.The hepatic sinus disappeared，and the hepatocytes were denatuated and necrotic.The boundary between red pulp and white pulp is unclear; Jejunum villi become shorter and broken; however，the tissue structure of lung，liver，spleen and jejunum of mice in the TCM intervention group was less damaged，which was closer to that of mice in the blank control group.Conclusion：Bushen Jiedu Formula can prevent ionizing radiation damage and protect important organs.
Keywords Bushen Jiedu Formula; Lonizing radiation; Lung tissue; Liver tissue; Spleen tissue; Jejunal tissue; Pathological morphology; Radiation damage
中圖分类号：R285.5;R289.5文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.07.014
随着国内社会经济的迅猛发展，当今核能及放射性核素被广泛应用于能源、医疗各领域，如核能发电、清洁能源的开发、示踪检测、辐射治疗等，极大促进了国民经济的发展，人类在享受核技术带来社会进步福利的同时，伴随的辐射损害不容忽视。本团队在前期动物实验研究发现，高剂量电离辐射可引发小鼠食欲减退，毛色晦暗，毛发片状脱落，体质量下降，精神萎靡[1]，大便稀溏，抵抗力下降等现象，甚至死亡;解剖小鼠尸体，肉眼可见部分小鼠肺脏局部瘀血或水肿，脾脏萎缩或有瘀血、脾脏指数明显低于正常对照组，有的小鼠肝表面出现白色结节、肝肿大、腹水、胃肠胀气[2]，采用补肾解毒方干预的小鼠一般情况及脏器损伤程度较辐射模型组轻。为了探讨补肾解毒方对电离辐射小鼠脏器保护作用，本研究对空白对照组、辐射模型组、中药干预组（补肾解毒方）小鼠肺、肝、脾、空肠4个重要脏器病理形态学进行观察。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 动物 60只清洁级健康C57BL/6J雄鼠，3月龄，体质量（20±2）g，由北京维通利华实驗动物技术有限公司提供，实验动物许可证号：[SCXK（京）2012-0001]。自由摄食饮水，进食普通颗粒饲料，北京师范大学生命科学院实验动物中心动物房饲养，动物房保持恒温，22 ℃，湿度60%～90%。
1.1.2 药物 补肾解毒方（山萸肉12 g，熟地黄、牡丹皮、茯苓、山药、泽泻、白花蛇舌草各10 g，冬虫夏草3 g组成），由康仁堂药业公司提供配制的中药颗粒剂。正式实验前加无菌水配成浓度为1.38 g/mL的混合液，按人体给药剂量换算成小鼠等效剂量给药，小鼠给药剂量为13.5 g/（kg·d）。
1.1.3 试剂与仪器 60Coγ-辐照装置（北京师范大学化学学院，北京伽玛高新有限公司，型号：GM-11-03-A）。光学显微镜（奥林巴斯光学显微镜，编号：BX53）。GS-伊红染色液（哈尔滨格林标本技术开发有限公司，批号：161020）、GS-苏木素染色液（哈尔滨格林标本技术开发有限公司，批号：161116）。
1.2 方法
1.2.1 分组与模型制备 60只C57BL/6J雄鼠采用随机数字表法分为空白对照组、辐射模型组、中药干预组（补肾解毒方），每组20只。适应性饲养2 d后，3组均连续灌胃10 d，第11天除空白对照组外，辐射模型组、中药干预组给予一次性5 Gy60Coγ-射线照射（鼠笼置于伽马源可照射区域内，等距离放置，剂量率1 Gy/min，总时长约5.00 min）。
1.2.2 给药方法 中药干预组每天上午8：00给予补肾解毒方灌胃0.2 mL。其他2组给予等容积生理盐水灌胃，3组均连续灌胃10 d，第11天5 Gy60Coγ-射线照射，照射后继续上述方式灌胃14 d。
1.2.3 检测指标与方法 各组小鼠于辐射后第14天取材。小鼠称重后取材，摘眼球采血，断颈处死后迅速取肺、肝、脾、空肠，将右肺中下叶、肝右叶、脾脏下1/2、空肠上1/2用中性甲醛固定、脱水、石蜡包埋、4 μm厚切片，苏木精-伊红染色，光镜下观察肺、肝、脾、空肠组织结构。
2 结果
2.1 各组小鼠肺的病理形态改变 图1提示空白对照组小鼠肺组织结构完整清晰，肺泡壁完整，肺泡腔未见明显断裂;辐射模型组小鼠肺组织结构较紊乱，肺泡腔不完整，断裂明显，间质大量淋巴细胞、浆细胞为主的炎症细胞浸润，伴见小静脉充血;中药干预组小鼠肺泡结构较清晰，部分肺泡间隔增宽，少量肺泡壁融合，间质少量淋巴细胞浸润。
2.2 各组小鼠肝脏病理形态改变 图2提示空白对照组小鼠肝脏组织结构完整，细胞大小一致，胞质丰富，汇管区清晰可见;辐射模型组小鼠肝窦消失，静脉淤血，胞质内糖原颗粒减少，肝细胞变性、坏死;中药干预小鼠肝细胞轻度水肿，胞核轻度固缩，汇管区结构存在。
2.3 各组小鼠脾脏病理形态改变 图3提示空白对照组小鼠脾脏红、白髓分界清楚，淋巴细胞丰富，生发中心明显可见巨核细胞;辐射模型组小鼠脾脏红、白髓界限不清，红髓充血，白髓淋巴细胞结构紊乱，巨核细胞增多，间质纤维组织增生;中药干预组小鼠脾脏红、白髓分界尚可，凋亡淋巴细胞减少，巨核细胞较辐射组减少，红髓未见明显充血。
2.4 各组小鼠空肠病理形态改变 图4提示空白对照组小鼠小肠绒毛呈圆锥状，排列紧密，吸収细胞排列紧密整齐，细胞核位于基底膜处，纹状缘清晰;辐射模型组小鼠空肠小肠绒毛变短、断裂，淋巴滤泡脱落，吸収细胞排列松散;中药干预组小鼠空肠刷状缘排列紧密、规则，散在淋巴细胞浸润。
3 讨论
研究认为射线为热毒、火毒之邪，本病起病急骤，病势危重，变化多端。由于电离辐射作用的特点，其毒邪兼具火热邪气的特点，热毒蕴于体内，充斥三焦，所以对机体多个脏器均可能造成严重损伤，影响其生理功能，产生痰浊、瘀血、癌肿等病理产物[3]。
肺为娇脏，为清虚之体居于高位，温邪上受，首先犯肺，火热之邪灼伤肺络，逼津外泄，迫血妄行。因此，电离辐射小鼠肺组织会出现炎性渗出、炎症细胞浸润、静脉充血、甚至出血等病理变化，这与张洁曼等[4]报道的小鼠急性放射性肺损伤模型组小鼠肺组织病变以渗出为主，肺间质及肺泡壁毛细血管扩张充血，间质水肿，肺泡壁轻度增厚，同时伴有炎症细胞的浸润相一致。束明慧等[5]采用15、18、20 Gy 60Coγ-射线进行大鼠全肺照射，发现15 Gy照射后大鼠肺部以急性炎症为主，28 d部分炎症吸收，而18、20 Gy照射的大鼠肺部可见较多的炎症细胞浸润，后期可出现肺泡塌陷、肺间质有大量炎症细胞浸润，也支持本研究急性肺损伤的病理变化。肺主呼吸，朝百脉，通调水道，放射性肺损伤将影响小鼠呼吸功能、心肺循环及上焦水液代谢，严重会导致呼吸衰竭。
肝是重要的解毒器官，电离辐射会对肝功和肝酶产生一系列变化，从而影响肝脏物质代谢的改变，产生放射性肝炎甚至肝纤维化。王磊等[6]发现X线辐射会导致肝细胞核缩小、部分消失以及肝细胞质空泡样变性;卢志伟等[7]研究指出电离辐射后模型组大鼠肝细胞体积会增大，肝窦扩张.肝索紊乱，中央静脉及被膜处肝细胞水肿淡染，细胞核大小、形态不规则，细胞界限不明显，大量炎症细胞浸润。本实验也是发现电离辐射可以破坏肝脏组织结构，出现肝窦消失，肝细胞变性、坏死的情况。
脾脏是机体重要的免疫器官，是各种免疫细胞发生、分化、发育以及成熟的场所，当机体受到外界抗原刺激后会在脾脏内发生免疫应答，通过产生各类免疫细胞和免疫分子来清除抗原，对于维持机体免疫功能发挥至关重要作用[8]。免疫系统对电离辐射损伤极为敏感，是重要的靶器官，电离辐射会诱导机体产生一系列特异性和非特异性免疫应答，脾脏内含大量的淋巴细胞和巨噬细胞，如果遭受辐射损伤，释放大量的内源性危害因子，会严重影响机体免疫功能，甚至危及生命[9]。本研究发现电离辐射导致小鼠脾脏白髓、红髓结构发生明显变化，影响脾的免疫应答功能，机体免疫力下降;同时辐射后巨核细胞增多，会导致血小板增多，小鼠血液出现一种高凝状态，增加发生栓塞和肿瘤的风险。
小肠主受盛化物，泌别清浊，既是食物消化的主要场所，也是营养物质吸收的重要部位，电离辐射后小鼠食欲下降，體质量减轻与小肠功能受损息息相关，本研究发现电离辐射空肠绒毛变短、断裂，绒毛数量减少，肠道胀气，极大影响小鼠的消化功能。张跃伟等[10]在观察急性放射性肠炎指出小鼠辐射后空肠早期出现微血管充血、扩张及红细胞溢出，主要表现为血管通透性增加，随后被破坏导致血管数量减少，符合急性放射性肠损伤的特征。急性放射性肠损伤临床上也表现为腹痛、腹胀、腹泻、胃肠胀气、大便失禁、直肠出血，严重可致死[11]。
由此可以看出，电离辐射作用靶点是多脏器，并非单一脏器受损，辐射后小鼠状态与其脏腑受损程度密切相关。辐射后小鼠呼吸微弱或急促、鼠毛脱落、毛色晦暗，与肺的功能密切相关，肺主呼吸，肺部炎性渗出、充血水肿势必会影响肺泡气体交换功能，出现呼气困难;肺主皮毛，火邪灼肺，肺津亏虚，毛发失去滋养，导致脱落、色泽晦暗。辐射后小鼠食欲下降、体质量减轻、大便稀溏，与消化道功能下降密切相关，小肠消化吸收、泌别清浊功能失调，小肠绒毛的断裂会导致水谷精微吸收能力下降，不能满足机体的需求。辐射后小鼠精神萎靡，抵抗力、免疫力下降与肝、脾功能障碍有关，肝脾结构破坏，脾萎缩，解毒排毒、细胞再生能力减弱，会导致机体气血津液亏虚，瘀血、痰饮病理产物形成。辐射粒子中伤机体，多系统同时受到损伤，是电离辐射伤的典型特征。
前期研究发现，补肾解毒方能有效降低高剂量辐射急性损伤的致死率。补肾解毒方（熟地黄10 g，山茱萸12 g，山药、牡丹皮、茯苓、泽泻、白花蛇舌草各10 g，冬虫夏草3 g组成）是基于我们前期实验和临床观察，由滋补肾阴基础方六味地黄丸化裁而来。六味地黄丸肝脾肾并补，尤补肾之真阴，张汉群等[12]研究发现六味地黄丸+同步放化疗的患者治疗后CD3+和CD4+T淋巴细胞数量比治疗前明显增多，且CD4+/CD8+比值明显上升，与治疗前相比差异有统计学意义（P0.05），考虑六味地黄丸能增加或刺激CD3+和CD4+T淋巴细胞生成，认为六味地黄丸能提升骨髓造血干细胞、胸腺、脾脏等免疫器官功能，还能增强细胞免疫和体液免疫，生成抗体和细胞因子，调节免疫相关基因表达，从而增强器官清除自由基及拮抗免疫抑制的能力，说明六味地黄丸具有调节机体免疫、抗肿瘤的作用。张蓉等[13]认为辐射为火毒之邪，易耗津伤阴，最损肾中真阴，电离辐射其致病发病及防治均与肾阴亏虚密切相关，以六味地黄丸为基础方防治辐射损伤，符合中医辨证施治原则。考虑辐射后脾胃运化功能减弱，熟地黄质润滋腻，故熟地黄用量减至10 g，再加冬虫夏草3 g以提高机体免疫力、白花蛇舌草10 g以清热凉血解毒，所以我们认为从肾生理功能而言，肾主骨，藏精生髓，能防治辐射对机体造血和免疫系统的损害;从五行特性而言，肾属水，水克火，能减轻具有火热之性的电离辐射对机体的烧灼伤[14]。冬虫夏草具有补肺益肾、止血化痰之效，补肾解毒方中用之，既取其“阳中求阴，阴得阳生而泉源不绝”之意，增加六味地黄丸滋阴清热之力，又能抑制机体病理产物生成。因此，选用冬虫夏草加强补肾填精力量符合电离辐射伤的发病机制。现代医学研究也验证这一点，Sheu等[15]研究发现冬虫夏草具有调节免疫、抗肿瘤、抗氧化、保护肝肾、抗炎等功效，费新雄等[16]临床研究中将非小细胞肺癌放疗分为2组，其中1组患者从放疗开始同时加服百令胶囊（主要成分为虫草菌丝体干粉），口服，2 g/次，3次/d，直至放疗结束，发现加服百令胶囊组患者放射性肺炎发生率明显低于对照组，差异有统计学意义（P<0.05），同时C反应蛋白、红细胞沉降率水平放疗后百令组明显低于放疗前，差异有统计学意义（P<0.05），认为百令胶囊可以抑制肺癌放疗照射野局部组织分泌大量细胞因子，明显减低胸部放疗的不良反应，可以延缓急性放射性肺炎的发生、发展。故选用冬虫夏草可以降低电离辐射损伤，保护机体重要脏器。白花蛇舌草具有清热解毒、消痈散结、利尿除湿之功，善清火热毒邪，减低辐射火热之性对机体脏腑的直接影响，同时可以防止瘀血病理产物的形成，并通过“下法”促进病理代谢产物排出。临床报道可将白花蛇舌草用来治疗肺炎、肝炎、肠炎等多种炎症疾病及肿瘤，郭洪梅等[17]发现白花蛇舌草水提取物可以促进肺癌细胞的凋亡，抑制肺癌细胞的增殖，当白花蛇舌草剂量达到600 μg/mL，肺癌细胞抑制率可达到95%（P<0.01），具有显著的体内抗癌细胞活性。杨新周等[18]提取多地白花蛇舌草样品中黄酮、多酚、多糖成分，分析各成分的抗氧化能力，发现白花蛇舌草中黄酮和多酚含量与抗氧化活性高度相关，白花蛇舌草通过阻止辐射后机体内产生自由基，发挥抗氧化、消炎、抗肿瘤效应。
石鹏展等[19]认为辐射致病特点与中医学中“火邪”致病特点相符，具有耗损人体气阴、耗血动血、易致肿瘤的特点，严重者甚至可以扰乱心神，出现神志不安、烦躁、谵妄、发狂、昏迷等症，他提出临床上可以考虑采用清热解毒的方法治疗电离辐射，白花蛇舌草的选用正好符合其致病机制及治疗原则。因此，诸药合用，共奏扶正祛邪之功，能发挥较好的辐射防护效应。杨利丹等[20]也曾指出补肾解毒方可能通过TLR4信号途径显著减轻辐射损伤，保护免疫器官，有较理想的辐射防护作用。
本研究结果正好验证这一点，病理图片显示采用补肾解毒方灌胃的中药干预组小鼠接受一次性5 Gy 60Coγ-射线照射后，肺、肝、脾及空肠这些重要脏器组织结构破坏程度明显轻于辐射模型组小鼠，并且炎症细胞浸润数量少，考虑补肾解毒方可能通过抑制炎症反应、提升抗氧化能力，从而发挥保护机体重要脏器的功能;同时也提示补肾解毒方防治电离辐射伤是对机体多个脏器同时发挥作用，其作用靶点可能是分布在这些脏器上的共有某种受体，值得我们进一步研究。
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（2020-03-03收稿 责任编辑：苍宁）
