黔北麻羊小反刍兽疫免疫血清的制备方法
何启刚+黄开荣
摘要：免疫血清是紧急预防和早期治疗相应传染病的有效制剂。对黔北麻羊小反刍兽疫免疫血清的制备方法进行了介绍。
关键词：黔北麻羊；小反刍兽疫；免疫血清；制备方法
中图分类号：S858.26 文献标识码：B 文章编号：1007-273X（2016）06-0032-01
免疫血清是用纯制的抗原多次接种于适当的成年健康动物，刺激其产生免疫应答，血清中含有大量特异性抗体，又称抗血清。可以直接取用，也可将血清抗体提纯为精致免疫球蛋白。小反刍兽疫（peste des petits ruminants，PPR），又名小反刍兽伪牛瘟，是由小反刍兽疫病毒引起的一种急性病毒性传染病。主要感染小反刍动物，以发热、口炎、腹泻、肺炎为特征。OIE将其列为A类疫病。我国规定为一类动物疫病。免疫血清是紧急预防和早期治疗相应传染病的有效制剂。本文对黔北麻羊小反刍兽疫免疫血清的制备方法进行了介绍，供参考。
1 免疫用动物
以黔北麻羊为免疫用动物，要求反应良好，1～3岁，雄性，健壮，无感染性疾患，能够提供足够数量的血清。此外还需十分注意羊的饲养，以消除羊的个体差异以及在免疫过程中死亡的影响。
2 免疫方法
采用肌肉分点注射；每点注射1头份，每次注射4～6个点。首免后8 d免疫第二次。免疫时用不完全佐剂。在第2次加强免疫后2周，取静脉血2～3 mL，制备血清，检测抗体效价。如未达到预期效价，需再次进行加强免疫，直到满意时为止。当抗体效价达到预期水平时，即可放血制备抗血清。
3 佐剂
由于不同个体对同一抗原的反应性不同，而且不同抗原产生免疫反应的能力也有强有弱，因此常常在注射抗原的同时，加入能增强抗原的抗原性物质，以刺激机体产生较强的免疫反应，这种物质称为免疫佐剂。佐剂除了延长抗原在体内的存留时间，增加抗原刺激作用外，更主要的是它能刺激网状内皮系统，使参与免疫反应的免疫活性细胞增多，促进T细胞与B细胞的相互作用，从而增强机体对抗原的细胞免疫和抗体的产生。常用的佐剂是弗氏佐剂，其成分通常是羊毛脂1份、石腊油5份，羊毛脂与石腊油的比例视需要可调整为1∶2～9（V/V），这是不完全弗氏佐剂，在每毫升不完全弗氏佐剂中加入1～20 mg卡介苗就成为完全佐剂。配制方法：按比例将羊毛脂与石蜡油置容器内，用超声波使之混匀，高压灭菌，置4 ℃下保存备用。免疫前取等体积完全或不完全佐剂与免疫原溶液混合，用振荡器混匀成乳状，也可以在免疫前取需要量佐剂置乳钵中研磨，均匀后再边磨边滴加入等体积抗原液（其中加卡介苗3～4 mg/mL或不加），加完后再继续研磨成乳剂，至滴于冰水上5～10 min内完全不扩散为止。为避免抗原损失，亦可用一注射器装抗原液，另一注射器装佐剂，二者以聚乙烯塑料管连接，然后二者来回反复抽吸，约数十分钟后即能完全乳化。检查合格后即以其中一注射器作注射用。
4 抗血清的采集与保存
采羊颈静脉血。采血前停止喂料8 h（只给水），每只羊每次可收集160～200 mL。然后用棉球压迫止血，凝血后洗去二甲苯。2周后，可再次放血。此法可反复多次放血。放血过程中要严格按无菌要求进行。收集的血液置于室温下1 h左右，凝固后，置4 ℃下过夜（切勿冰冻）析出血清，4 000 r/min离心10 min。在无菌条件下吸出血清，加适量青、链霉素，分装，贮于-40 ℃以下冰箱，或冻干后贮存于4 ℃冰箱保存。
5 抗血清质量的评价
在免疫期间，同一动物在不同的时间内抗血清效价、特异性、亲合力等都可能发生变化，因而必须经常采血测试。只有在对抗血清的效价、特异性、亲合力等方面作彻底的评价后，才可使用所取得的抗血清。
5.1 效价
用小后刍兽疫阻断ELISA抗体检测试剂盒检测抗血清效价，效价就是指血清中所含抗体的浓度或含量，即免疫羊中PPRV抗体水平。此法测定的效价极为精确。如抗血清阳性对照阻断率（PB）大于70就可以用来做抗血清。
5.2 特异性测定
血清的特异性或称专一性是指抗血清对相应的抗原及近似的抗原物质的识别能力。特异性好就是抗血清的识别能力强。通常特异性是以交叉反应率来表示的。交叉反应率低，表示抗血清的特异性好，反之则特异性差。交叉反应率一般是用竞争抑制曲线来判断的。以不同浓度的抗原和近似抗原物质分别做竞争抑制曲线，计算各自的结合率（B/T或B/B0），求出各自在IC50时的浓度，按下列公式计算交叉反应率。S=y/Z×100%，式中，S为交叉反应率，y为IC50时抗原浓度，Z为IC50时近似抗原物质的浓度。如某抗原的IC50浓度为90 Pg/管，而一些近似抗原物质IC50浓度几乎是无限大，可以说这一抗血清与其他抗原物质的交叉反应率近似零，即无交叉反应，该抗血清的特异性是好的。
5.3 亲合力
在免疫学中，亲合力是指抗体与结合抗原体的活度或牢固度。抗体与抗原结合疏松，结合后会迅速解离，称为亲合力低，反之亲合力高。亲合力的高低是由抗原分子的大小、抗体分子的结合位点与抗原的决定基之间的立体结构型的合适程度决定的。亲合力常以亲合常数K表示。K的单位是升/摩尔（L/mol）。在RIA中，K是该抗血清能达到的最小检出量（灵敏度）的倒数，K=1/[H]，[H]是最小检出量，通常，K的范围在108～1012 L/mol之间，也有高达1014 L/mol的。计算亲合常数的方法有20余种，计算出的K都不能真实反映试验情况，只能作为参考。
6 免疫失败的可能原因及应采取的措施
有时不能获得满意的抗血清，可从下列几方面找原因，并改进之。一是抗原质量是否良好，可改用其他厂家的产品或改用同一厂家的其他批号，也可考虑改变抗原分子的部分结构，或改进提取方法。二是所用的佐剂是否合适，乳化是否完全，可改用其他佐剂，或加强乳化。三是免疫的方法、剂量，加强免疫的间隔时间和次数，免疫的途径是否合适。四是动物的饲养是否得当，如营养（饲料、饮水）、环境卫生（通风、采光、温度）是否符合要求，动物的健康情况是否良好等。
