KLF5转录因子对预测乳癌肺转移的临床意义

2022.07.03

刘鑫徐静綦瑶林高阳王慧哲邹晓

[摘要] 目的探討Kruppel样因子5（KLF5）及其下游基因在乳癌组织中的表达，分析其与乳癌病理特点的相关性及在预测乳癌肺转移中的临床意义。

方法应用免疫组织化学方法，检测乳癌肺转移乳癌组织（35例）、乳癌无肺转移乳癌组织（35例）、乳腺良性肿瘤组织（20例）及乳癌肺转移原发灶癌旁正常组织（20例）KLF5、肿瘤坏死因子-α诱导蛋白2（TNFAIP2）和β-连环蛋白（β-catenin）表达，分析各因子表达与乳癌肺转移病人临床病理特征间的关系，Kaplan-Meier生存分析模型分析各因子表达与乳癌病人5年无远处转移生存率（DFS）及总生存率（OS）的相关性，单因素卡方检验和多因素二元Logistic回归模型分析KLF5、TNFAIP2和β-catenin对乳癌肺转移风险的预测价值。

结果乳癌肺转移组KLF5（χ2=25.881，P<0.01）、TNFAIP2（χ2=23.669，P0.05）。Kaplan-Meier生存分析显示，乳癌病人KLF5、TNFAIP2和β-catenin表达与DFS（χ2=5.371～7.084，P<0.05）、OS（χ2=4.152～7.670，P<0.05）显著相关。单因素和多因素分析表明，KLF5表达是乳癌发生肺转移的独立危险因素（HR=3.246，95%CI=1.197～12.046，P=0.034）。

结论 KLF5、TNFAIP2和β-catenin在乳癌肺转移乳癌组织中高表达且KLF5可能为预测乳癌肺转移风险的分子标志物。

[关键词] 乳房肿瘤;肿瘤转移;Kruppel样转录因子类;生物标记，肿瘤

[中图分类号] R73-37

[文献标志码] A

[文章编号] 2096-5532（2021）03-0339-06

doi：10.11712/jms.2096-5532.2021.57.121

[开放科学（资源服务）标识码（OSID）]

[网络出版] https：//kns.cnki.net/kcms/detail/37.1517.R.20210628.1618.003.html;2021-06-29 09：38：39

CLINICAL SIGNIFICANCE OF KRUPPEL-LIKE FACTOR 5 TRANSCRIPTION FACTOR IN PREDICTING LUNG METASTASIS OF BREAST CANCER

LIU Xin， XU Jing， QI Yao， LIN Gaoyang，? WANG Huizhe， ZOU Xiao

（Department of Breast Surgery， Qingdao University Affiliated Central Hospital， Qingdao 266042， China）

[ABSTRACT]Objective To investigate the expression of Kruppel-like factor 5 （KLF5） and its downstream genes in breast cancer tissue， as well as their association with the pathological features of breast cancer and their clinical significance in predicting lung metastasis of breast cancer.

Methods Immunohistochemistry was used to measure the expression of KLF5， TNF-α-induced protein 2 （TNFAIP2）， and β-catenin in breast cancer tissue with lung metastasis （35 cases）， breast cancer tissues without lung metastasis （35 cases）， benign breast tumor tissue （20 cases）， and adjacent breast tissue of breast cancer with primary lung metastasis （20 cases）， and the association of the expression of each factor with the clinicopathological features of patients with lung metastasis of breast cancer was analyzed. The Kaplan-Meier survival analysis model was used to investigate the correlation of the expression of each factor with 5-year distant metastasis-free survival （DFS） and overall survival （OS） of patients with breast cancer， and the univariate chi-square test and the multivariate binary logistic regression analysis were used to analyze the value of KLF5， TNFAIP2， and β-catenin in predicting the risk of lung metastasis of breast cancer.

Results Compared with the other three groups， the breast cancer+lung metastasis group had significantly higher positive expression rates of KLF5 （χ2=25.881，P<0.01）， TNFAIP2 （χ2=23.669，P0.05）. The Kaplan-Meier survival analysis showed that in breast cancer patients， the expression of KLF5， TNFAIP2， and β-catenin was significantly asso-

ciated with DFS （χ2=5.371-7.084，P<0.05） and OS （χ2=4.152-7.670，P<0.05）.

The univariate and multivariate analyses showed that KLF5 expression was an independent risk factor for lung metastasis of breast cancer （HR=3.246，95%CI=1.197-12.046，P=0.034）.

Conclusion KLF5， TNFAIP2， and β-catenin are highly expressed in breast cancer tissue with lung metastasis， and KLF5 can be used as a molecular marker for predicting the risk of lung metastasis of breast cancer.

[KEY WORDS]breast neoplasms; neoplasm metastasis; kruppel-like transcription factors; biomarkers， tumor

乳癌目前仍是全球女性中最常见的恶性肿瘤，发病率、死亡率持续上升，为仅次于肺癌的女性癌症死亡的第二大原因[1-2]。乳癌综合治疗模式的出现使部分早期、局部晚期、局部复发病人被治愈，而一些病人在诊断时已出现远处转移，5年生存率仅约20%[3]。90%乳癌病人的死亡源于癌转移。乳癌细胞优先侵及肺、骨、肝、脑等器官，其中肺转移治疗效果最差，中位生存期仅22个月，在死亡的转移性乳癌病人中肺转移占60%～70%[4-5]。研究乳癌肺转移的机制，寻找更敏感高效的预测分子标志物和新的治疗方法是该领域的核心问题。

Kruppel样因子5（KLF5）是一种含有锌指结构的转录因子，在肿瘤发生发展中调控大量基因的表达，在声门上型喉癌淋巴结转移、肾透明细胞癌以及前列腺癌等多种肿瘤的发生、发展中发挥重要作用[6]。然而，目前关于KLF5及其下游基因表达对乳癌肺转移风险预测作用的研究尚无。本研究通过免疫组织化学的方法检测 KLF5、肿瘤坏死因子-α诱导蛋白2 （TNFAIP2）和β-连环蛋白（β-catenin）在不同乳房组织中的表达，分析各因子表达与乳癌肺转移的关系。现将结果报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

2011年1月—2016年1月，选择青岛大学附属青岛市中心医院手术切除且临床病理资料完整的乳房组织标本110例，其中乳癌肺转移组（A组）35例，乳癌无肺转移组（B组）35例，乳房良性肿瘤组（C组）20例，乳癌肺转移癌旁组（D组）20例。研究纳入乳房肿瘤病人均为女性，年龄24～70岁，平均（51.03±11.31）岁;截至2019年9月，随访时间27～93月，平均（49.94±20.18）月。组织学分级根据改良Scarff-Bloom-Richardson法分为1～3级。根据雌激素受体（ER）、孕激素受体（PR）、人表皮生长因子2（HER-2）、增殖细胞相关核抗原（Ki67）等表达情况将乳癌分为Luminal A型、Luminal B1型、Luminal B2型、HER-2过表达型、三阴型（TNBC）[7]。35例乳癌肺转移病人中，25例有淋巴结转移;Luminal A型2例，Luminal B1型14例， Luminal B2型1例， HER-2过表达型11例，TNBC 7例。

1.2 入组标准和排除标准

入组标准：①临床资料完整，包括一般情况、肿瘤分期（TNM分期，参考AJCC TNM分期标准（第8版））[8]、治疗恢复情况、首发肺部转移肿瘤的大小（以病理报告肿瘤的最大直径为准）、位置、数目等;②经穿刺或手术切除病理（WHO标准）确诊为乳癌;③经PET-CT或肺部强化CT、纤维支气管镜活检、穿刺活检、手术后病理（WHO标准）检测确诊合并肺转移。排除标准：①合并原发肺癌以及其他恶性肿瘤肺转移的病人;②合并有其他严重危及生命的器质性病变、其他恶性肿瘤及转移的病人;③病历资料记录不完整无法提取重要數据者。

1.3 KLF5、TNFAIP2、β-catenin表达水平检测

采用免疫组织化学SP法。石蜡标本4 μm切片，依次置于新鲜二甲苯、无水乙醇、体积分数0.95乙醇、体积分数0.75乙醇中进行脱蜡水化，EDTA抗原修复液（pH值8.0，北京中杉金桥生物技术有限公司）修复。所用一抗为KLF5（ab137676，Abcam，UK;稀释度1∶200）、TNFAIP2（ab196659，Abcam，UK;稀释度1∶200）、β-catenin（ab32572，Abcam，UK;稀释度1∶250），切片加入一抗恒温（37 ℃）孵育120 min，采用通用SP试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司，SP-9000）检测，DAB显色液（北京索莱宝公司）显色;苏木精复染，封片，光学显微镜下观察。

1.4 免疫组织化学结果判定

结果判读由两位病理专家（主任医师）独立进行，采用盲法评分。在光镜下每张切片随机选取10个高倍镜视野（400倍），计数KLF5、TNFAIP2、β-catenin染色情况。KLF5阳性染色以细胞核为主，TNFAIP2阳性染色主要定位于细胞质和高尔基体[9]，β-catenin阳性染色位于细胞膜和细胞质[10]，镜下表现为棕褐色（强阳）或浅黄色（弱阳）。根据染色细胞占比进行评分：0分，70%的肿瘤细胞染色。根据染色强度评分：0分，阴性;1分，弱;2分，温和;3分，强。根据染色强度与染色细胞占比评分乘积判定免疫反应结果：总分0，免疫反应阴性（N）;总分1～7分，低免疫反应性（L）;总分8～12分，高免疫反应性（H）。

1.5 统计学分析

采用SPSS 23.0软件进行统计学分析。计数资料比较采用χ2检验及Fisher精确检验;绘制Kap-lan-Meier生存曲线，log-rank法比较各组生存率差异;采用多因素二元Logistic回归模型分析乳癌肺转移的独立危险因素，计算風险比（HR）和95%置信区间（CI）。P<0.05表示差异有显著性。

2 结? 果

2.1 不同乳房组织KLF5、TNFAIP2和β-catenin表达比较KLF5、TNFAIP2和β-catenin的免疫组织化学染色见图1。乳癌肺转移组、乳癌无肺转移组、乳房良性肿瘤组以及乳癌肺转移癌旁组织组KLF5、TNFAIP2和β-catenin表达比较，差异均具有统计学意义（χ2=25.881、23.669，P<0.05;P=0.002）。见表1。

a1～a4为KLF5表达免疫组织化学染色：a1，乳癌肺转移组;a2，乳癌无肺转移组;a3，乳房良性肿瘤组;a4，乳癌肺转移癌旁组。b1～b4为TNFAIP2表达免疫组织化学染色：b1，乳癌肺转移组;b2，乳癌无肺转移组;b3，乳房良性肿瘤组;b4，乳癌肺转移癌旁组。c1～c4为β-catenin表达免疫组织化染色：c1，乳癌肺转移组;c2，乳癌无肺转移组;c3，乳房良性肿瘤组;c4，乳癌肺转移癌旁组。SP法，400倍。

2.2 KLF5、TNFAIP2和β-catenin表达与乳癌病人生存率关系

log-rank分析显示，乳癌病人KLF5、TNFAIP2和β-catenin表达与5年无远处转移生存率（DFS）（32.4% vs 69.7%，χ2=6.645，P<0.05;29.0% vs 66.7%，χ2=7.084，P<0.05;30.4% vs 59.6%，χ2=5.371，P<0.05）、总生存率（OS）（83.8% vs 97.0%，χ2=4.152，P<0.05;80.6% vs 97.4%，χ2=5.539，P<0.05;78.3% vs 95.7%，χ2=7.670，P<0.05）显著相关。见图2。

2.3 乳癌肺转移组TNFAIP2、β-catenin和KLF5表达与临床病理特征关系

乳癌肺转移组KLF5、TNFAIP2、β-catenin表达与其组织学分级、脉管内癌栓有关，TNFAIP2、β-catenin表达与淋巴结转移有关（Fisher精确检验P=0.001～0.048），β-catenin表达还与肿瘤大小有关（Fisher精确检验P=0.048）;各因子表达均与年龄、分子亚型、ER、PR、HER-2、Ki67及生存状态无关（P>0.05）。见表2。

2.4 乳癌病人临床病理特征对肺转移风险的影响

单因素卡方检验分析显示，脉管内癌栓（OR=4.231，95%CI=1.550～11.546，P=0.004）、KLF5（OR=4.792，95%CI=1.741～13.188，P=0.002）、TNFAIP2（OR=9.785，95%CI=1.759～13.586，P=0.002）、β-catenin（OR=3.368，95%CI=1.164～9.744，P=0.022）表达和包块大小（OR=3.852，95%CI=1.401～10.590，P=0.008）是乳癌发生肺转移的危险因素。多因素二元Logistic回归模型分析显示，KLF5是乳癌病人发生肺转移的独立预测因素（HR=3.246，95%CI=1.197～12.046，P=0.034）。二元Logistic回归模型采用基于最大似然估计的向前逐步回归法进行变量筛选，将无统计学意义的自变量脉管内癌栓、TNFAIP2表达、β-catenin表达和包块大小剔除方程外，有意义的变量解释为KLF5表达病人发生肺转移的风险为KLF5不表达者的3.246倍。见表3。

2.5 乳癌肺转移病人乳癌组织KLF5、TNFAIP2和β-catenin表达之间的关系

本文35例乳癌肺转移病人乳癌组织连续切片，同一组织进行KLF5、TNFAIP2、β-catenin检测，结果均为高免疫反应性2例，均为低免疫反应性13例，免疫反应均阴性8例，免疫反应性不同12例。相关分析显示，KLF5与TNFAIP2（r=0.443，P=0.008）、KLF5与β-catenin（r=0.501，P=0.002）、TNFAIP2与β-catenin（r=0.492，P=0.003）表达呈同向性相关。见表4～6。

3 讨? 论

乳癌特异性肺转移的发生与多种因素相关，即通过某种方式影响肿瘤细胞转移前微环境从而促进或抑制乳癌发生肺部的定向转移，其中包括基因、蛋白、免疫细胞及相关信号通路等。研究发现，一些基因和蛋白可作为预测肺转移风险的生物标志物，如癌基因同源基因1、转化生长因子-β等[11-12]。KLF5是涉及癌症许多信号通路的重要调控因子，其表达经常出现异常，在某些肿瘤中发挥促癌或抑癌作用，是潜在的肿瘤标志物。有研究表明，KLF5与下游靶标形成的KLF5-ILK-Ecadherin信号通路通过参与声门上型喉癌的上皮间质转化过程促进淋巴结转移，与局部复发显著相关[5];KLF5的表达与乳癌发生发展有关，可通过泛素-蛋白酶体系统促进肿瘤细胞的侵袭转移。此外，有研究发现β-catenin异位表达能够促进乳癌淋巴结转移，与癌细胞的高侵袭、高转移相关[13]，而KLF5蛋白或mRNA与β-catenin在远处转移风险最高的TNBC中明显共表达[14]。DEY等[15]研究也显示，Wnt/β-catenin通路激活的TNBC，相比其他部位肺转移风险更高。而KLF5对于保持Wnt信号通路的完整是必要的，其特异性缺失可降低通路中β-catenin表达[16]。TNFAIP2为肿瘤相关炎症的主要递质，在肿瘤微环境中发挥重要作用，过表达可通过激活Wnt/β-catenin信号通路促进食管鳞癌的增殖和转移[10]，是KLF5的直接下游靶基因。KLF5可通过上调TNFAIP2转录，促进乳癌细胞增殖、侵袭和迁移[17]。但KLF5、TNFAIP2、β-catenin在乳癌肺转移过程中的作用及具体机制仍不清楚。

本研究采用免疫组织化学法检测了110例乳房组织标本KLF5、TNFAIP2和β-catenin的表达，结果显示3个因子表达水平在乳癌肺转移乳癌组织、乳癌无肺转移乳癌组织、乳房良性肿瘤组织及乳癌肺转移原发灶癌旁组织之间显著不同，乳癌肺转移乳癌组织中3个因子的表达明显上调。对这些分子标志物表达水平与肺转移病人的临床病理学特征关系分析显示，乳癌肺转移组的KLF5、TNFAIP2、β-catenin表达均与乳癌组织学分级、脉管内癌栓有关，TNFAIP2、β-catenin表达与淋巴结转移有关，β-catenin表达与肿瘤大小有关;各因子表达均与年龄、分子亚型、ER、PR、HER-2、Ki67及生存状态无关。本研究随访结果显示，KLF5、TNFAIP2和β-catenin表达与DFS、OS显著相关，脉管内癌栓和KLF5、TNFAIP2、β-catenin表达及包块大小是乳癌发生肺转移的危险因素，而KLF5表达是乳癌发生肺转移的独立危险因素。说明KLF5过表达与乳癌肺转移风险增加有关，可作为预测乳癌肺转移风险的分子标志物。

综上所述，KLF5、TNFAIP2与β-catenin在乳癌肺转移的乳癌组织中高表达且彼此相关，KLF5-TNFAIP2-β-catenin途径与乳癌特异性肺转移有关，KLF5通过调控相关蛋白在肺转移过程中发挥重要作用。本文研究局限性在于样本数量相对偏少，乳癌肺转移与KLF5、TNFAIP2、β-catenin表达相关性及具体机制有待大样本研究和体外细胞实验加以验证。

[参考文献]

[1]FAHAD ULLAH M. Breast cancer： current perspectives on the disease status[J].? Advances in Experimental Medicine and Biology， 2019，1152：51-64.

[2]SIEGEL R L， MILLER K D， JEMAL A. Cancer statistics， 2019[J].? CA： a Cancer Journal for Clinicians， 2019，69（1）：7-34.

[3]SLEDGE G W Jr. Curing metastatic breast cancer[J].? Journal of Oncology Practice， 2016，12（1）：6-10.

[4]JIN L T， HAN B C， SIEGEL E， et al. Breast cancer lung metastasis： molecular biology and therapeutic implications[J].? Cancer Biology & Therapy， 2018，19（10）：858-868.

[5]DAN Z L， CAO H Q， HE X Y， et al. A pH-responsive host-guest nanosystem loading succinobucol suppresses lung metastasis of breast cancer[J].? Theranostics， 2016，6（3）：435-445.

[6]李響，宁倩，戴诗琴，等. 转录因子KLF5在恶性肿瘤发生中作用的研究进展[J].?? 中南医学科学杂志， 2019，47（3）：225-229.

[7]PATA G， GUAINERI A， BIANCHI A N， et al. Long-term outcomes of immunohistochemically defined subtypes of breast cancer less than or equal to 2 cm after breast-conserving surgery[J].? Journal of Surgical Research， 2019，236：288-299.

[8]GIULIANO A E， EDGE S B， HORTOBAGYI G N. Eighth edition of the AJCC cancer staging manual： breast cancer[J].? Annals of Surgical Oncology， 2018，25（7）：1783-1785.

[9]JIA L， SHI Y D， WEN Y， et al. The roles of TNFAIP2 in cancers and infectious diseases[J].? Journal of Cellular and Molecular Medicine， 2018，22（11）：5188-5195.

[10]XIE Y B， WANG B. Downregulation of TNFAIP2 suppresses proliferation and metastasis in esophageal squamous cell carcinoma through activation of the Wnt/β-catenin signaling pathway[J].? Oncology Reports， 2017，37（5）：2920-2928.

[11]INAGUMA S， RIKU M， ITO H， et al. GLI1 orchestrates CXCR4/CXCR7 signaling to enhance migration and metastasis of breast cancer cells[J].? Oncotarget， 2015，6（32）：33648-33657.

[12]PADUA D， ZHANG X H F， WANG Q Q， et al. TGFbeta primes breast tumors for lung metastasis seeding through angiopoietin-like 4[J].? Cell， 2008，133（1）：66-77.

[13]潘勇权，胡惠军，古彩红，等. 乳癌中β-catenin蛋白表达及细胞内定位与意义[J].? 中国医学工程， 2017，25（5）：7-9.

[14]TANG J M， LI Y X， SANG Y Z， et al. LncRNA PVT1 regulates triple-negative breast cancer through KLF5/beta-catenin signaling[J].? Oncogene， 2018，37（34）：4723-4734.

[15]DEY N， BARWICK B G， MORENO C S， et al. Wnt signaling in triple negative breast cancer is associated with metastasis[J].? BMC Cancer， 2013，13：537.

[16]ZHUANG X Q， ZHANG H， LI X Y， et al. Differential effects on lung and bone metastasis of breast cancer by Wnt signalling inhibitor DKK1[J].? Nature Cell Biology， 2017，19（10）：1274-1285.

[17]JIA L， LIU R， CHEN C S. Abstract 4042： kruppel-like factor 5 promotes breast cancer proliferation， migration and invasion partially through upregulating the transcription of TNFα-induced protein 2[C]//Molecular and Cellular Biology. American Association for Cancer Research， 2015.

（本文編辑黄建乡）