多层纸芯片培养体系研究外泌体介导的乳腺癌细胞-肺成纤维细胞相互作用
林谆 陈晓 林冬果 刘大渔
摘?要?采用多层纸芯片共培养体系研究了外泌体介导的乳腺癌细胞-肺成纤维细胞相互作用。多层纸芯片体系包含接种乳腺癌细胞成份的肿瘤层，接种肺成纤维细胞的招募层，以及上述两层之间的侵袭层。叠加多层纸芯片形成包含乳腺癌细胞和肺成纤维细胞的三维共培养体系，而拆解多层纸芯片则逐层检测细胞，因而可以从时间和空间角度解析细胞间相互作用。研究了在肿瘤层接种乳腺癌细胞或固定乳腺癌细胞来源的外泌体，发现二者同样可以诱导招募层的肺成纤维细胞转化为肿瘤相关成纤维细胞。之后，在招募层种植外泌体诱导的肿瘤相关成纤维细胞，其显示出较原生细胞更强的乳腺癌细胞招募作用。研究结果表明，转移前微环境的形成主要在于肿瘤外泌体介导的宿主器官成纤维细胞转化，而宿主器官微环境的改变反之招募肿瘤细胞定向迁移。
关键词?纸芯片;乳腺癌;成纤维细胞;外泌体;共培养;转移前微环境
1?引 言
肿瘤转移具有明显的器官选择性[1，2]，其中一个重要原因在于肿瘤细胞与宿主器官之间存在信息交流，从而引发宿主器官形成转移前微环境，后者促进肿瘤细胞的转移性种植[3，4]。近期的大量研究显示，外泌体是肿瘤细胞与外界进行信息交流的重要媒介[5]。外泌体来源于细胞内溶酶体微粒内陷形成的多囊泡体，经多囊泡体外膜与细胞膜融合后释放到胞外基质中，其成分包含复杂RNA和蛋白质。外泌体在肿瘤转移中发挥了重要作用，尤其是可以改造远端脏器细胞，进而诱导肿瘤细胞迁移和定植[6]。因而，研究外泌体介导的肿瘤定向迁移对于肿瘤转移机制和转移干预研究具有重要价值。鉴于播散的肿瘤细胞中只有少部分能够在转移前微环境中存活并形成肿瘤[7，8]，通过宏观水平解析外泌体介导的肿瘤迁移具有极大的难度。因此，迫切需要发展能够以简单的手段研究外泌体介导的肿瘤-远端脏器的动态相互作用的肿瘤转移模型。
目前，用于研究肿瘤转移的模型主要包括动物水平和细胞水平两类。相较于动物模型，细胞水平肿瘤转移模型能够更直接和清晰地反映细胞迁移行為[9～13]。例如，经典的Transwell实验是利用包含多孔薄膜的装置检测肿瘤细胞的跨膜迁移行为。然而，Transwell实验有一些限制，包括使用二维培养细胞，不能仿真肿瘤细胞的体内结构形式;由于扩散效应，跨膜化学环境差别难以长期维持;无法研究肿瘤细胞在迁移过程中的动态变化。鉴于外泌体介导的肿瘤-远端脏器动态相互作用是一个长期过程，因而，相关研究需要一种既可长时间保持微环境稳定性，又能够动态解析细胞-微环境相互作用的研究工具。
纸基微流控芯片是构建细胞仿生环境的有利工具。纸是一种具有多孔结构的生物兼容性材料，可作为支架实现三维细胞长期培养[14，15]。此外，借助于图形化加工获得的纸芯片可以实现多区域细胞培养，能够实现高通量细胞分析[16～18]。纸芯片可以进一步叠加，构建更为复杂的细胞培养体系。这类多层纸芯片被尝试用于肿瘤细胞-微环境相互作用研究，并显示出独特的优势：可以将含有不同微环境组分的纸张堆叠起来，充分再现微环境的复杂性[14，16];多层叠纸结构允许信号分子的交流，并能长期保持化学浓度梯度[19，20]。这种非血管结构可以简便地形成复杂的化学浓度梯度，为细胞相互作用研究提供有利条件;拆分多层叠纸结构可以将从特定层回收的细胞对应迁移过程中的特定阶段，有助于从时间和空间角度解析细胞-微环境相互作用。基于以上优点，多层纸芯片培养体系是研究外泌体介导的肿瘤细胞-微环境相互作用的有力工具。
本研究设计了一种多层纸芯片培养体系，用于研究外泌体介导的乳腺癌细胞-肺成纤维细胞相互作用。多层纸芯片由肿瘤层、侵袭层和招募层组成，其中，肿瘤层接种乳腺癌细胞或固定乳腺癌细胞来源外泌体，招募层接种肺成纤维细胞，侵袭层将这两层分隔。叠加多层纸芯片形成包含乳腺癌细胞和肺成纤维细胞的三维共培养体系，而拆解多层纸芯片则可以逐层检测细胞。利用此多层纸芯片工具，分析共培养体系内不同层面上细胞的形态、结构和功能，从时间和空间角度解析外泌体介导的肿瘤细胞-宿主器官相互作用。
2?实验部分
2.1?仪器与试剂
Optima XPN-80 超速离心机（美国Beckman公司）;SZ-100Z纳米颗粒分析仪 （法国HORIBA公司）;JEM-1400plus扫描电镜（日本JEOL公司）;IX71倒置荧光显微镜（日本Olympus公司）;Ti-E A1共聚焦显微镜（日本Nikon公司）。
PBS、DMEM 培养基、0.25% 胰蛋白酶-EDTA 溶液、细胞核染料DAPI、钙黄绿素/AM（Calcein/AM）、鬼笔环肽（Phalloidin）（美国Thermo Fisher公司）;α-SMA一抗、Vimentin一抗（美国Abcam公司）;FITC荧光标记二抗（武汉博士德公司）;胎牛血清（美国Sigma公司）;多聚甲醛、海藻酸钠（上海生工公司）;CaCl2（罗恩公司）;BCA试剂盒（江苏碧云天公司）;人肺成纤维细胞株HLFs来自中山大学;乳腺癌细胞株MDA-MB-231和MDA-MB-453来自中国科学院上海细胞生物研究所。
2.2?纸芯片的加工
纸芯片使用Whatman 105擦镜纸以蜡染方法加工[21]。单张纸芯片尺寸为8 cm×3 cm，包含10个蜡染疏水屏障封闭的圆形亲水区，亲水区直径8 mm，间隔8 mm。图形化纸片在150℃下烘烤10～15 s，将蜡融化并渗透到纸全层。之后，纸片在乙醇浴中消毒30 min，在层流罩中经紫外线照射后，风干。
2.3?细胞培养
人乳腺癌MDA-MB-231和MDA-MB-453细胞、HLFs用DMEM完全培养基（含10%胎牛血清），在37℃、5% CO2条件下常规培养。回收的细胞重悬于含2%海藻酸钠的DMEM培养基中，备用。
2.4?外泌体的提取与鉴定
培养至第三天，收集乳腺癌细胞培养液，500 r/min离心10 min，取上清液，12000 r/min离心20 min，去除凋亡小体和细胞碎片，上清液以120000 r/min离心70 min，获得外泌体。将外泌体用20 mL PBS清洗后，再次超速离心，收集的外泌体用PBS重悬，进行扫描电镜检测，并用纳米粒子分析仪进行粒径分析。使用BCA试剂盒测定外泌体浓度。
2.5?外泌体处理肺成纤维细胞
HLFs以50000细胞/孔的密度接种于六孔板中，每孔添加10 μg/mL 乳腺癌细胞来源外泌体。每3天补充1次培养基。
2.6?多层纸芯片共培养体系的构建
纸芯片上的细胞培养步骤：（1）将细胞重悬于2%海藻酸盐-DMEM溶液，以106细胞/mL密度接种于纸芯片亲水区，每个区域约5000个细胞;（2）向接种区加入40 mmol/L CaCl2溶液，静置2 min，形成海藻酸钙凝胶;（3）接种细胞的纸芯片置于含DMEM的培养皿中，于5% CO2培养箱中37°C孵育過夜;（4）将各层纸芯片按照顺序组装。如图1所示，多层纸芯片培养体系包含肿瘤层、侵袭层和招募层。肿瘤层接种MDA-MB-231和MDA-MB-453乳腺癌细胞或上述细胞来源的外泌体，招募层接种HLFs，两层之间由侵袭层隔开，亲水区域为不含细胞的海藻酸钙凝胶。此外，招募层和邻近的侵袭层之间插入一层PC膜，防止肿瘤细胞进入招募层。多层纸芯片由定制的聚四氟乙烯夹板固定。组装完成后，多层纸芯片顶层夹板的开孔处加入DMEM溶液，装置于37℃、5% CO2培养箱中孵育培养，每天换液。
2.7?芯片上的细胞检测
培养3天后，拆卸纸芯片装置，将每层纸芯片各置于单独的培养皿中，以PBS清洗2遍，37℃下Calcein-AM 染色孵育10 min。纸芯片置于倒置显微镜下拍摄，荧光图像用Image J软件分析。细胞分布计算公式为Fi/Ft×100%，其中，Fi为某层某亲水区的荧光强度，Ft为各层同一位置亲水区荧光强度之和。
2.8?细胞免疫荧光分析
拆解的单层纸芯片置于培养皿中，以4%多聚甲醛固定，室温孵育20 min，以PBS冲洗3次后，用4% BSA封闭。招募层纸芯片细胞培养区用抗α-SMA 一抗（1：500稀释） 和抗 Vimentin一抗 （1∶500 稀释）于4℃孵育12 h，再用FITC二抗标记，37℃孵育1 h。细胞核用1 μg/mL DAPI染色。纸芯片用PBS冲洗3次后，置于共聚焦显微镜下拍摄，荧光图片用Image J软件分析。
3?结果与讨论
3.1?多层纸芯片培养体系的构建
为研究外泌体介导的肿瘤-远端脏器动态相互作用，构建了一种多层纸芯片培养体系。多层纸芯片培养体系的优势在于既可通过组装获得包含复杂微环境的培养体系，又可通过拆解获得每个层面上的细胞信息。本研究设计的多层纸芯片的每层含有10个亲水区域，因而允许进行平行的细胞-微环境相互作用研究。多层纸芯片培养体系包含肿瘤层、侵袭层和招募层（图2），并在招募层和邻近侵袭层之间插入一层多孔PC膜，以防止侵袭层和招募层之间的细胞串扰。
将这种多层纸芯片共培养体系用于外泌体介导的乳腺癌-肺相互作用研究。多层纸芯片体系中，接种乳腺癌细胞的肿瘤层模拟原发乳腺癌，接种HLFs的招募层模拟肺，两层之间的数层侵袭层模拟肿瘤细胞的转移途径。完成培养后，将多层纸芯片拆解，不同层面纸芯片对应细胞迁移的不同阶段。逐一分析不同层面上细胞的形态、结构和功能，可以从时间和空间角度解析外泌体介导的肿瘤细胞-宿主器官相互作用。侵袭层中出现肿瘤细胞是肿瘤迁移的证据，由培养条件对肿瘤迁移的影响可以获知微环境因素在肿瘤转移过程中发挥的作用。
这种多层纸芯片培养体系为研究外泌体介导的研究乳腺癌细胞-HLFs相互作用提供了有利的工具：一方面，将乳腺癌细胞来源外泌体固定于肿瘤层，观察其对HLFs的转化作用;另一方面，在招募层种植外泌体诱导的肿瘤相关成纤维细胞，观察其对乳腺癌细胞招募作用。借助于多层纸芯片培养体系，从时间和空间角度解析外泌体介导下转移前微环境的形成及其对肿瘤转移的影响。
3.2?纸芯片上的乳腺癌细胞与肺成纤维细胞的共培养
将乳腺癌细胞（MDA-MB-231和MDA-MB-453）置于肿瘤层，将HLFs置于招募层，将芯片组装后培养。为了更好地模拟体内条件，将肿瘤层置于底层缺氧环境，将招募层置于顶层富氧环境。共培养结束后，拆解多层纸芯片，用死/活细胞荧光染色标记各层纸上的细胞。结果表明，不同纸层上的细胞活性良好（图3A）。
与单独培养相比，乳腺癌细胞-HLFs共培养条件下HLFs细胞活性无明显变化（图3B），而乳腺癌细胞的活性则有所提高（图3C）。此结果表明，多层纸芯片不仅能够提供充足的氧气和养分，还可通过细胞间相互作用提高肿瘤细胞的活性。
3.3?乳腺癌细胞来源的外泌体激活肺成纤维细胞
研究了多层纸芯片共培养体系中肿瘤层和招募层细胞之间的相互作用。与文献[22]报道相似，本研究同样观察到肿瘤细胞通过旁分泌效应促进成纤维细胞转变成肿瘤相关成纤维细胞。在纸芯片共培养体系中，将肿瘤层置于中间层（L3），招募层位于顶层（L6），在共培养不同时间后，检测HLFs的波形蛋白（Vimentin）的表达情况。与不同乳腺癌细胞共培养的两组实验中，HLFs中波形蛋白表达随培养时间延长而增加（图4）。此结果表明，原发癌灶的肿瘤细胞参与宿主器官转移前微环境的形成，而此过程具有时间依赖性。
鉴于外泌体是肿瘤细胞与其它细胞信息交流的一个重要途径[23]，进一步研究了外泌体在肺成纤维细胞向肿瘤相关成纤维细胞转化过程中发挥的作用。制备并确认了乳腺癌细胞来源外泌体（图5A），并将纯化得到的外泌体固定在多层纸芯片的肿瘤层，与HLFs共培养。免疫荧光检测结果表明，培养后的HLFs中，波形蛋白和α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）表达均增高（图5B），说明外泌体诱导了HLFs转变成CAFs。因此，可以认为外泌体的传输是形成肿瘤转移前微环境的一个重要途径，其主要作用在于诱导肿瘤相关成纤维细胞的形成。
3.4?肿瘤相关成纤维细胞诱导的乳腺癌细胞定向迁移
为了研究来自宿主器官的招募效应对乳腺癌细胞的影响，检测了向招募层转移的乳腺癌细胞数量。将肿瘤层置于底层（L2），招募层置于顶层（L6）。利用Calcein-AM染色检测各层的细胞密度，进而表征细胞在共培养体系中的分布情况。MDA-MB-231和MDA-MB-453细胞都向招募层迁移，侵袭层的细胞密度显示招募作用的强弱。实验发现，大部分乳腺癌细胞都转移至第4层和第5层。与HLFs共培养时，有40.97%±6.56% 的MDA-MB-453 细胞和19.86%±2.57% MDA-MB-231细胞迁移到侵袭层;与CAFs共培养时，MDA-MB-453细胞的迁移比例增长到62.97%±4.95%，而 MDA-MB-231细胞提高到44.97%±2.74%（图6）。细胞迁移结果表明，CAFs在促进肿瘤转移过程中起着重要的作用，而CAFs又是由外泌体诱导HLFs形成。由此得出，在肿瘤的转移过程中，肿瘤细胞分泌的外泌体诱导HLFs转变成CAFs，形成转移前微环境;CAFs招募肿瘤细胞转移至宿主器官。因此，多层纸芯片的共培养体系是研究肿瘤细胞和宿主器官细胞相互作用的有力工具。骨细胞、神经细胞、肝细胞等其它细胞也可置于招募层，利用多层纸芯片模型可研究肿瘤不同器官定向迁移的机制。
4?结 论
设计的多层纸芯片共培养体系具有以下特性： 便于加入不同类型的细胞用于研究肿瘤与宿主迁移的相互作用;基于纸层堆叠形成的共培养方法能够模拟体内微环境;拆解多层纸芯片允许从时间和空间上研究细胞间相互作用。基于以上优势，这种多层纸芯片共培养体系是肿瘤器官倾向性转移机制研究的有利工具。利用此多层纸芯片共培养体系研究了外泌体介导的乳腺癌细胞-HLFs相互作用。一方面，乳腺癌细胞分泌外泌体诱导肺成纤维细胞转化为肿瘤相关成纤维细胞;另一方面，外泌体诱导产生的肿瘤相关成纤维细胞反过来招募乳腺癌细胞。基于多层纸芯片共培养体系的细胞相互作用，研究证实了原位肿瘤细胞可通过外泌体诱导转移前微环境的形成，从而促进肿瘤细胞的定向迁移。
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