石墨相氮化碳光诱导活化辣根过氧化物酶及其比色免疫分析应用

    张岚 李小琴 王光丽

    

    

    

    摘?要?基于石墨相氮化碳（g-C3N4）在可见光（≥ 400 nm）照射下可激活辣根过氧化物酶（HRP），使HRP能够催化氧化特征底物3，3'，5，5'-四甲基联苯胺（TMB），设计了一种新型夹心型免疫传感器，用于高灵敏检测甲胎蛋白（AFP）。此夹心型免疫传感器利用附着于微孔板上的一抗（Ab1）捕获目标物AFP，然后与HRP和二抗（Ab2）共同标记的金纳米颗粒（Ab2-AuNPs-HRP）反应，并结合酰胺放大技术（TSA），增大表面固定的HRP的量，实现信号放大。加入g-C3N4后，在可见光照射下，HRP的活性被激发，TMB被氧化后的信号（即652 nm处的吸光度）与AFP的浓度在0.5 pg/mL～0.1 μg/mL范围内呈线性关系，检出限（LOD，S/N=3）为0.17 pg/mL。 本研究构建的新型免疫传感器具有灵敏度高、选择性好、使用方便等优点，在实际样品测定中具有潜在的应用价值。

    关键词?石墨相氮化碳;辣根过氧化物酶;活化;免疫分析

    1?引 言

    天然酶具有活性高、选择性和特异性好等优势，在生物分析中应用广泛。辣根过氧化物酶（HRP）是一种含亚铁血红素的蛋白质，具有性质稳定、比活性高、分子量小、容易制备等优点，在催化和分析检测等领域具有重要应用。通常利用H2O2以及浓H2SO4进行HRP活性的调控，由于使用了腐蚀性的化学试剂，因此操作不便，且对环境有污染。最近，利用纳米材料调控天然酶活性的研究备受关注。Fruk等[1]发现紫外光照射的CdS量子点可引发HRP的催化活性，氧化其荧光底物（中性红）;Kamda等[2，3]发现在紫外光或可见光激发下，铁掺杂的钛酸盐及铂掺杂的赤铁矿固体薄膜可激发并调控HRP的活性。最近，本研究组[4，5]发现邻苯二酚类化合物（如邻苯二酚、多巴）与二氧化钛纳米粒子结合后，在可见光激发下，也可活化HRP，氧化其特征底物3，3'，5，5'-四甲基联苯胺（TMB）。研究发现，在光照下，纳米材料可产生多种活性成分，如超氧阴离子（O·2）、空穴（h+）和羟基自由基（·OH）等，进而活化天然酶HRP，使其在无H2O2存在条件下也表现出较高的催化活性。利用光照后的纳米材料调控HRP催化活性的体系，可方便地通过调控光照的有无实时调控酶活性。光激发纳米材料为调控天然酶活性提供了一种简单方便、无需加入破坏性化学试剂的新途徑。但是，已报道的可调控HRP活性的纳米材料仍十分有限，部分纳米材料本身有毒性，而且有的材料需在紫外光下激发，但紫外光本身会导致HRP失活。因此，能够较好调控HRP活性的纳米材料，尤其是对纳米材料活化HRP体系的生物传感应用研究仍需进一步探索。

    石墨相氮化碳（g-C3N4）是一种生物相容性好、毒性低的无金属半导体材料，具有优异的荧光、光电转换、光催化等性质[6～8]。AFP是一种重要的临床肿瘤标志物，广泛应用于肝细胞肝癌和卵黄囊肿瘤的诊断，在胎儿缺陷和肿瘤（尤其是肝脏肿瘤）的临床诊断中具有重要作用[9]。 本研究发现，在可见光照射下，所合成的g-C3N4纳米片可活化HRP催化氧化底物TMB，产生较强的特征吸收信号。以甲胎蛋白（AFP）为模型物，在光照条件下，将g-C3N4纳米片活化HRP与酰胺放大技术（TSA）结合，建立了一种比色检测AFP的方法。研究结果表明，本方法具有简单方便、检测线性范围宽、灵敏度高等优点。

    2?实验部分

    2.1?仪器与试剂

    Hitachi S-4800扫描电子显微镜（日本Hitachi公司）;D8型X射线衍射仪（德国布鲁克公司）;FT-IR 6700光谱仪（美国Thermo Fisher公司）;拉曼光谱仪（英国Renishaw公司）;TU-1901分光光度计（北京普析通用仪器有限公司）;荧光分光光度计（美国Varian公司）;CELS5001350氙灯光源（北京中教金源科技有限公司）;酶标仪（美国SpectraMax M5公司）;CHI 800C型电化学工作站（上海辰华仪器有限公司）。

    癌胚抗原（CEA）、前列腺抗原（PSA）和甲胎蛋白（AFP）购自北京久峰润达生物技术公司;超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）和HRP购自美国Sigma-Aldrich公司;叔丁醇（TBA）、异丙醇（IPA）、乙二胺四乙酸（EDTA）、碘化钾（KI）、3，3'，5，5'-四甲基联苯胺（TMB）、鼠来源AFP抗体对（一抗Ab1、二抗Ab2）、N-羟基丁二酰亚胺（NHS）、1-乙基-3-（3-二甲基氨丙基）-碳化二亚胺（EDC）、牛血清白蛋白（BSA）、N-2-羟乙基哌嗪-N'-（2-乙磺酸）、酪胺、吐温-20、色氨酸（Trp）、丙氨酸（Ala）和人血清白蛋白（HSA）均购自国药集团化学试剂有限公司。血清样本来源于江南大学校医院。

    2.2?g-C3N4纳米片的合成

    参照文献[10]的方法，称取10.0 g三聚氰胺（C3N6H6）置于陶瓷坩埚中，在马弗炉中，以3℃/min加热至550℃，保持2 h，得到黄色的固体产物。研磨后，称取40 mg粉末于40 mL水中，超声10 h，悬浮液以5000 r/min离心15 min，得到g-C3N4纳米片。

    2.3?g-C3N4光诱导活化HRP性质的探究

    2.3.1?g-C3N4光诱导活化HRP?取50 μL 200 μg/mL g-C3N4和一定浓度的HRP于200 μL HAc-NaAc缓冲溶液（0.4 mol/L，pH 3.0）中，超声10 min，使g-C3N4分散。加入500 μmol/L TMB，用水稀释至1.0 mL，溶液混合均匀后，放置于氙灯（≥ 400 nm）下照射15 min，测定652 nm处的吸光度。

    2.3.2?g-C3N4光诱导活化HRP体系的催化动力学研究?在30℃下，将50 μL 200 μg/mL g-C3N4和100 μg/mL HRP加入200 μL HAc-NaAc缓冲溶液（0.4 mol/L，pH 3.0）中，再加入不同浓度的TMB溶液，用水稀释至1.0 mL，混合均匀，以TMB为底物，基于米氏方程计算反应动力学参数。在可见光照射下，每隔1 min测量652 nm处的吸光度，研究反应的动力学性质。

    2.4?基于光诱导g-C3N4活化HRP免疫检测AFP

    2.4.1?HRP/AuNPs/Ab2复合物的合成?参照文献[11]的方法，采用柠檬酸三钠还原HAuCl4合成金纳米粒子（AuNPs）。将AFP二抗（Ab2）和HRP共同固定在AuNPs上，获得HRP/AuNPs/Ab2复合物，合成步骤参照文献[12]： （1）用0.1 mol/L Na2CO3调节AuNPs溶液至pH 8～9;（2）取40 μL 100 μg/mL Ab2和160 μL 100 μg/mL HRP加入到1.0 mL AuNPs（Ab2和HRP的浓度为最佳比例）中，混合溶液在4℃下孵育12 h;（3）将混合溶液以12000 r/min离心20 min，移除过量的Ab2和HRP，HRP/AuNPs/Ab2复合物超声后，重新分散在1.0 mL PBS缓冲溶液（pH=7.4，含1.0%（w/w）BSA）中，于4℃避光储存。

    2.4.2?HRP/酪胺复合物的合成?参照文献[12]的方法合成HRP/酪胺复合物： 将600 μL 1.0 mg/mL HRP加入1.5 mL HEPES缓冲溶液（50 mmol/L，pH 9.3）中，室温超声5 min;将混合物用3.0 mol/L HCl调节至pH 7.3，将15 mg NHS和20 mg EDC加入到上述溶液中，室温搅拌45 min;将600 μL 5.0 mg/mL 酪胺溶液逐滴滴加到上述溶液，得到的混合溶液在室温下搅拌12 h;将混合溶液离心10 min，用蒸馏水洗涤两次，得到HRP/酪胺复合物;将其超声分散到500 μL PBS缓冲溶液（0.1 mol/L，pH 7.4）中，于4℃避光储存。

    2.4.3?比色法检测AFP?具体步骤如下： （1）20 μL 0.1 mg/mL AFP一抗（Ab1）加入到96微孔板中，在4℃条件下过夜，用洗涤液洗涤未吸附在微孔板上的Ab1，室温下加入20 μL 封闭液，静置2 h，封闭非特异性吸附位点，再用洗涤液洗涤;（2）20 μL不同浓度的AFP抗原加入微孔板中，室温下孵育1 h后洗涤;（3）20 μL HRP/AuNPs/Ab2復合物加入到上述溶液中，室温下孵育1 h后，洗涤;（4）室温下，依次将H2O2（5 μL，2 mmol/L）和酪胺/HRP复合物（10 μL）加入微孔板中，放置1 h后，洗涤;（5）将20 μL 10 μg/mL g-C3N4、100 μL醋酸缓冲溶液（0.4 mol/L，pH 3.0）和20 μL 500 μmol/L TMB加入微孔板中，置于氙灯（≥ 400 nm）下照射15 min，测定652 nm处的吸光度数值。

    3?结果与讨论

    3.1?g-C3N4的表征

    由图1A可知，g-C3N4具有石墨烯类似结构和不规则折叠状片层结构，尺寸约为1.5～2.5 μm。所合成的g-C3N4有两个明显的吸收峰，在（002）方向上，27.7°处的强峰为g-C3N4结构中石墨层间堆积吸收峰;在（100）方向上，13.02°处的弱衍射峰为周期性的平面结构衍射峰[13]。与大块g-C3N4相比[10]，27.5°处的衍射峰强移动到27.7°，表明纳米层状结构合成成功;13.02°处的峰变弱，表明石墨层的平面尺寸变小（图1B）。如红外光谱（FT-IR）（图1C）所示，在3000和3600 cm1处的宽吸收峰为NH和OH的伸缩振动峰，1000和1800 cm1处的吸收峰为CN杂环的伸缩振动峰，811 cm1处的吸收峰为三嗪环振动峰。由于g-C3N4表面富含OH、NH等亲水基团，使其具有良好的水溶性。图1D为g-C3N4的紫外-可见吸收光谱，在测试条件下，由于浓度较小，可见光区吸收不明显。在785 nm激发光下，g-C3N4在702和1231 cm1有典型的拉曼峰（图1E）。量子局限效应使得导带和价带向相反的方向移动[14]，导致荧光发射峰由大块g-C3N4的449 nm[15]蓝移至440 nm（图1F）。所制备的g-C3N4具有荧光性质，说明其具有光诱导电子激发/转移特性，具有光活性。

    3.2?可见光照射g-C3N4活化HRP及其机理

    在没有H2O2的条件下，g-C3N4经可见光照射可活化HRP。如图2所示，通过对比实验发现，不光照的g-C3N4或光照条件下的HRP，均不能明显地氧化TMB;而光照下的g-C3N4对TMB的氧化效果也较弱;只有光照条件下g-C3N4和HRP的混合物才能催化氧化TMB，使溶液变成蓝色。研究发现，纳米材料可产生多种活性中间体[4，5]（如·OH、H2O2、O·2和h+等）活化HRP。据此推断，在可见光照射下，g-C3N4通过产生某些活性中间体活化HRP，使其表现出催化氧化TMB的效果。

    为进一步阐明光照条件下g-C3N4活化HRP的机制，本研究引入了活性中间体的捕获剂，探究各种活性物质对体系催化氧化活性的影响。例如，叔丁醇（TBA）和异丙醇（IPA）可捕获·OH[16]，乙二胺四乙酸（EDTA）和KI可捕获h+ [17]，超氧化物歧化酶（SOD）可捕获O·2[18]，过氧化氢酶（CAT）可催化分解H2O2生成水和氧气。如图3A所示，与不含捕获剂相比，加入KI和SOD清除剂后，催化反应被抑制，可知h+和O·2是主要的活性成分。由光电化学实验结果可知，g-C3N4具有光诱导电子转移特性，在可见光开/关循环照射下，可产生光电流（图3B）。通过线性扫描测得g-C3N4的导带电位为1.13 V（相对于饱和Ag/AgCl，图3C），此电位比氧气的还原电位（0.046 V vs NHE[19]）更负。因此，可见光照射g-C3N4半导体，使得光生电子由价带跃迁至导带，导带上的电子还原溶解氧，产生O·2，进而活化HRP;而价带产生的h+可直接氧化HRP，将其转化为活化状态，进而氧化底物TMB[2]。

    通過光照的有无可调控g-C3N4/HRP的催化活性。如图3D所示，在光照条件下，oxTMB的吸光度明显增加;在无光照时，吸光度变化较小。停止光照射后，酶催化反应在很大程度上被抑制，这可能是活性中间体（O·2 和 h+）在酸性环境中寿命短[2]所致。相对于常规HRP体系通过加入浓H2SO4引起酶的变性以终止酶催化反应，本研究体系通过打开或关闭可见光源即可方便地调控HRP的活性。

    考察了g-C3N4活化HRP的实验中，光照时间和HRP的浓度对催化效果的影响。如图4A所示，g-C3N4/HRP起始反应速率较快，随着光照时间延长，反应趋于平衡;如图4B所示，固定g-C3N4的量，g-C3N4/HRP催化氧化TMB的效果随着HRP量的增加而增强，表明体系的氧化能力与HRP的量有直接关系。

    反应体系的pH值和反应温度都会影响g-C3N4/HRP的催化活性。由图5可知，g-C3N4/HRP催化体系的最适pH值和温度分别为pH 3.0和30℃。而常规HRP催化体系（以H2O2为活性激发物质）的最优pH值和温度分别为pH 3.0和40℃。

    进一步探究了g -C3N4/HRP体系的催化动力学特征。动力学参数由米氏方程的双倒数曲线υ= Vmax[S]/Km+[S]获得（其中，υ代表催化反应的初始速率，υmax代表最大反应速率，[S]和Km分别代表底物浓度和米氏常数）。如图6所示，计算得g-C3N4/HRP体系的Km=100 μmol/L，比HRP的Km（434.0 μmol/L[20]）小，表明g-C3N4/HRP对底物TMB的亲和力比HRP（以H2O2为活性激发物质）高。

    3.3?基于g-C3N4活化HRP的免疫分析方法检测AFP

    基于光照条件下g-C3N4可活化HRP，并利用TSA 技术[21]增大表面所固定的信号分子HRP的量，实现了AFP的检测，原理如图7所示，此夹心型免疫传感器利用附着于96孔板的一抗（Ab1）捕获目标物AFP，然后添加表面固定了二抗（Ab2）与HRP的金纳米粒子（即Ab2-AuNPs-HRP复合物），并通过酪胺和HRP的结合作用继续捕获合成的HRP-酪胺重复单元[21]，实现信号放大。在可见光照射下，加入的g-C3N4激发HRP活性，催化氧化特征底物TMB产生检测信号。通过实验可验证由TSA技术形成的HRP-酪胺重复单元可放大检测信号。如图8所示，无TSA时，检测信号低;有TSA时，检测信号增强。两者存在明显差别，说明形成的HRP-酪胺重复单元可放大检测信号。

    在最佳实验条件下，对所建立的新型免疫传感器检测AFP的性能进行了研究。由图9可知，体系的吸光度值与目标物AFP浓度的对数之间存在线性关系，线性范围为0.5 pg/mL～0.1 μg/mL，线性方程为y=0.071x（ng/mL）+0.277，R2=0.995，检出限为0.17 pg/mL （S/N=3）。与报道的AFP检测方法（表1）对比可知，本方法的检出限较低，具有较高的灵敏度。

    选择了一些阳离子（如K+、Na+、Zn2+、Mg2+、Ca2+）及与AFP性质相似的干扰物质（如人血清白蛋白（HSA）、色氨酸（Trp）、丙氨酸（Ala）、免疫球蛋白（人IgG、鼠IgG）、癌胚抗原（CEA）、前列腺抗原（PSA）），考察了本方法的选择性。 如图10所示，在相同的测定条件下，干扰物只产生较小的吸光度变化，表明本方法具有较好的选择性。

    3.4?人血清中AFP的检测

    将本方法应用于人血清样品中AFP的检测，结果如表2所示。测得人血清样品中AFP的含量为1.58 ng/mL，不同水平AFP的加标回收率为94.3%～101.3%，表明本方法可用于实际血清样品中AFP的检测。

    4?结 论

    在可见光照射下，g-C3N4纳米片可活化HRP，使HRP在没有H2O2存在时催化氧化TMB。基于此原理，结合TSA技术，本研究建立了比色法检测AFP的新型免疫分析方法，实现了AFP的超灵敏检测。

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