蓝狐细管冻精标准化生产技术的研究
尚成志 李明 于新生 王冠菊 鲍亚萍
摘要：解决狐狸精子在冷冻及解冻过程中会出现的复苏率低、形态结构异常，特别是顶体畸形率高的问题，筛选出一种理想的狐狸精液冷冻稀释液的配方，建立起一整套科学成熟规范的冷冻精液制作流程，实现狐狸细管型冷冻精液的工厂化、标准化、商业化生产，是摆在业内研究人员面前的一道难题。本公司科研人员通过不懈努力，实现了芬兰蓝狐细管冻精的标准化批量生产。用自己生产的不同批次的芬兰蓝狐细管冻精对本地狐狸人工授精，总受胎率达到了76%～85%。现就研究成果和主要做法与业界同仁分享，以共同推动狐狸冷冻精液人工授精技术的发展。
关键词：芬兰蓝狐;细管冻精;人工授精;精子顶体;受胎率
中图分类号：S829.9????? 文献标识码：B文章编号：2095-9737（2019）11-0013-02
动物人工授精技术的应用得益于雄性动物精液在体外的成功保存。精液的保存方式有三种，即常温保存（15～25℃）、低温保存（0～5℃）和超低温保存（-195.8℃）。动物人工授精技术经历了实验阶段、鲜精人工授精阶段和冷冻精液人工授精阶段。冷冻精液的剂型又分为颗粒型、安瓿型和细管型。目前细管型冻精是冷冻精液的最好剂型。因此细管冷冻精液制作，并用于人工配种是动物人工授精技术的最高阶段。
1 狐狸精液保存技术的概述及人工授精的优越性
狐狸品种多、分布广、野性强、胆小怕人、昼伏夜行、自然交配效果差。随着人工授精技术在家畜、家禽业上的成功应用，一些狐狸养殖企业和研究人员开始研究狐狸精液的保存技术和人工授精技术。实验证明：狐狸精子抵御超低温环境的能力很差，我国狐狸精液的冷冻保存技术的研究和应用一直在尝试，很难有超越或突破。
实施狐狸冷冻精液人工授精技术能极大限度地提高优良种公狐的配种效能，减少公狐的饲养成本;可解决因狐狸野性强、体格差异大、择偶性强、母狐拒配、母狐弓腰难配、母狐外生殖器畸形和不规则等因素导致的自然繁殖困难;可有效地降低传染病的传播，特别是能阻断生殖道器官接触而传播的疾病;方便种狐的引种和良种狐狸精液跨国、跨地区贸易;可提高种狐优良基因的扩散，加快新型品种扩繁培育速度;能有效地克服由于不同种属间、不同地域间狐狸由于发情配种时间不一致而造成的生殖隔离现象，实现赤狐、银黑狐与北极狐属间的种属间杂交。
2 狐狸精液冷冻保存的现状及技术壁垒
冷冻精液就是将人工采集的动物的新鲜精液，加入稀释液、防冷、防冻、抑菌等保护性物质及营养物质，经冷冻和保存之后，再解冻融化，使用专门的器械输送到发情雌性动物生殖道的一定部位，使其受胎生殖后代所用的精液。
目前，在我国狐狸养殖尚属于特种养殖，养殖规模小、从业人员少，政府对此行业的关注度和投入不高，相关技术的研究和应用发展缓慢，仍未达到一定的水平。人们对狐狸人工授精的应用多限于“现采立输”阶段，对冷冻精液的研究多限于相对落后的、濒临淘汰的颗粒冻精制作与应用阶段。
在动物冷冻精液的三种剂型中，颗粒型在成熟的冻精生产中已不再使用，安瓿型也逐渐被淘汰，细管型冻精具有使用方便、卫生、安全、不易污染、受胎率高，便于标记、携带、运输、储存等优点，实现种狐的系谱管理和冻精的标准化批量生产。
狐狸精子的头部呈扁卵圆形，头部主要由核和顶体构成，核内含有遗传物质DNA。核的前部在质膜下为帽状双层结构的顶体，内部有多种与受精作用有关的酶，是一个极不稳定的结构，它的畸形、缺损或脱落会使精子的受精能力降低或完全丧失。精子顶体的异常率高低是评定精液品质好坏的重要指标。有机体正常的形态结构是确保其正常功能的前提和基础。
大量研究发现：狐狸精子在超低温下冷冻、保存及解冻会对精子的整体结构，特别是头部顶体造成一定的损伤。有研究人员从银狐精子冷冻前后超微结构变化中发现银狐精子在冷冻前后头部顶体形态发生了很大变化，冷冻前的精子头部吸附了大量的精清物质，精子赤道段的密度较低，而冷冻后精子损伤主要在头部顶体，顶体层疏松，轻度膨胀，电子密度下降，表面凹凸不平，内容物大部分流失，顶体外膜部分空泡化，原有物质被一串大小不等的空泡所取代，顶体开始变大，出现褶皱、扭曲、分布不均的现象，并伴有部分脱落，完整率仅为35%～40%，进而影响到母狐的受胎率。
因此筛选出一种适合狐狸精液冷冻的稀释保护剂配方，建立一整套科学成熟的冷冻精液制作流程，仍然是摆在业内研究人员面前的一道难题。
3 蓝狐细管冻精标准化生产技术程序
近年来黑龙江省大兴安岭地区图强林业局、黑龙江省博龙牧业有限责任公司联合扎兰屯职业学院畜牧兽医系专业技术人员开展技术攻关，筛选狐狸冷冻精液稀释保护液中的添加物质种类、单位溶液添加量及配比，通过多重对比实验，确定了稀释保护液的理想配方。深入研究精液稀释的次数、稀释温度、降温幅度、平衡温度及时间等关键技术，终于取得了突破性进展，实现了狐狸细管型冷冻精液的标准化、批量生产。其主要技术如下所述。
3.1 良种公蓝狐的引进与精液采集
引进芬兰10～36月龄纯种健康的公蓝狐150只，对成年种公狐进行人工驯导，采用按摩法采精，取得蓝狐的鲜精。
3.2 精液品質检查
使用精子检测分析系统对精子的活力，密度、形态结构、顶体完整率、总畸形率、有效精子数、精液pH值、精子活力变化情况等指标进行检查。鲜精的活率在0.8以上，密度为5亿～8亿/ mL，总畸形率在20%以下，符合制作冷冻精液的品质要求。
3.3 精液冷冻稀释液的配制
研究结果显示：以葡萄糖-果糖-三羟甲基氨基甲烷（Tris）-柠檬酸-卵黄-甘油液作为细管冻精冻稀释液效果最佳。稀释液分为不含卵黄、甘油的基础液、基础液+卵黄配制成的稀释Ⅰ液、Ⅰ液+甘油配制而成的稀释Ⅱ液。
3.4 精液稀释、降温与平衡
取20～25℃品质合格的精液20 mL，加入同温度的基础液20 mL，搅拌混匀后，置于1500 r/min离心机中离心3 min，弃去上清液与底部杂质，剩余的浓份精液约为20 mL。
取离心后的浓份精液，轻轻摇匀，在20～25℃温度下，1∶1地加入稀释Ⅰ液，进行第二次稀释。
取经过第二次稀释后的精液，缓慢降温到4℃，1∶1地加入同温度的含8%甘油的稀释Ⅱ液，进行第三次稀释。值得说明的是，第三次稀释液是分三次加入的，每次加入总量的1/3，间隔时间10 min。
将降温至4℃，经过第三次稀释的精液放入4℃冰箱中平衡30 min，让甘油充分地渗透到精细胞内，发挥其膜内保护剂的防冻功能。
3.5 精液品质抽检
取出少许平衡后的精液，升温到室温，镜检观察活率的变化情况，按以上规程正确操作，活率可达到0.6，密度检测仪检测精子数为1亿～2亿/mL，有少部分精子出现弯曲、形态肿胀现象。
3.6 分装、封口
将平衡后品质合格的精液摇匀，放入4℃细管分装机中进行分装、封口。其实在此过程中，精子仍处于平衡的状态中。
3.7 冷冻与保存
将分装好的细管码盘放入程序冷冻仪中，按照预先设定好的冷冻曲线进行冷冻。冷冻结束后取出，放入拇指罐包装机内进行包装，并做好相关记录与标签，放入液氮罐中进行保存。
3.8 抽样解冻，检查活力
从液氮罐中随机取出细管冻精10支，放入40℃的温水浴中约10 s，进行解冻，在显微镜下检查精液品质。解冻后精子的活力不低于0.4，总畸形率不高于25%，顶体异常率不高于15%，每支细管中的有效精子数不少于1500万。
3.9 冻精日常保管
定时向液氮罐中充入液氮，液氮量不少于总容量的30%，确保冻精细管能全部没入液氮中。
3.10 冻精运输
配送冻精细管前，要再次检查精液品质指标，确保冻精品质，并向用户提供种公狐的系谱资料。冻精运输要遵循安全、平稳、及时的原则，在液氮罐内完成运输过程。
4 细管冷冻精液人工授精实验
4.1 狐狸发情鉴定
用外部观察法、结合放对试情和排卵检测仪检查卵泡发育情况，进行发情鉴定，确定最佳输精时间。
4.2 冻精解冻与装枪
将冻精细管放入42℃的温水浴中，解冻10～12 s，取出后，用脱脂棉拭去细管上水分，用专用细管剪剪去封口端，裝入输精枪内。
4.3 输精
用输精枪专用套管打开母狐的阴道，插入适当深度，插入输精枪，缓慢将精液注入子宫颈深部。为确保受胎率，观察母狐的发情表现，在第一次输精后8～10 h，再输精1次，1次发情输精次数一般不超过3次。
