灯心草发酵液中总黄酮和多糖的超声波提取工艺研究

    董雨卓 赵馨怡 孟盼 袁其方 于治鑫 张志国

    

    

    

    摘 要：采用保加利亚乳杆菌发酵传统中草药灯心草，以灯心草发酵液为研究对象，采用超声波法对发酵品中总黄酮和多糖进行提取。在单因素试验的基础上进行正交试验，以获得灯心草发酵液中总黄酮和多糖的最佳提取工艺条件，结果表明：在乙醇浓度为50%、料液比为1∶25、超声提取时间为40min、超声提取功率为500W的工艺条件下，灯心草发酵液中总黄酮的最佳得率为4.65%，多糖的最佳得率为7.41%，提取工艺最为理想。

    关键词：灯心草;发酵液;总黄酮;多糖;提取工艺

    中图分类号 R282.71文献标识码 A文章编号 1007-7731（2021）07-0015-04

    Optimization of the Extraction Technology of Total Flavone and Polysaccharide from Juncus Effusus Fermentation liquor

    DONG Yuzhuo et al.

    （Bioengineering College of Daqing normal University， Daqing 163712， China）

    Abstract： Traditional Chinese herbal medicine Juncus Effusus was fermented by Lactobacillus bulgaricus， The Extraction Technology of Total flavone And Polysaccharide from Juncus Effusus Fermentation liquor. On the basis of single test， orthogonal experimental design was studied through the central composite design.The optimum extraction technology was determined as follows：Ethanol concentration 50%， 1iquid-to-solid-ratio 1：25mL， ultrasonic time 40min and ultrasonic power 500W.Under such conditions， the predicted and experimental values of total flavone and polysaccharide from Juncus effusus fermentation liquor were 4.65% and 7.41%， respectively.

    Key words： Juncus effusus; Fermentation liquor; Total flavone; Polysaccharide; Extraction technology

    燈心草中草药为灯心草科灯心草属植物灯心草的茎髓或全草，其茎髓中含有挥发油、黄酮类、酚类等多种成分，作为传统中草药在治疗疾病方面的研究和应用十分广泛，主治水肿、小便不利、心烦不寐、小儿夜啼等症[1]。中草药发酵在中药研究开发和中药材资源的保护和利用等方面为科研工作者提供了新的思路[2]，其过程是将中药材进行萃取提纯与作为菌种的益生菌菌群进行厌氧发酵，对提取的中药有效成分进行生物学转化。目前，关于灯心草的研究报道主要以灯心草的化学成分和药理作用研究为主，而结合微生物发酵的相关研究则较少。为此，本试验利用星点设计-效应面法和正交试验设计优化灯心草乳酸杆菌发酵品中多糖和黄酮类成分的超声提取工艺进行研究，以优选出操作简单、得率较高的工艺条件，为灯心草的进一步综合利用提供科学依据。

    1 仪器与试药

    仪器：电子分析天平、紫外-可见分光光度计、数控超声波清洗器、超微粉碎机、离心机、隔水式电热恒温培养箱、鼓风干燥箱等。

    药品及材料：灯心草中药饮片（康美药业股份有限公司）;芦丁标准品（含量≥98%，购自中国药品生物制品检定所）;葡萄糖标准品（含量≥98%，购自中国药品生物制品检定所）;保加利亚乳杆菌（大庆师范学院生物工程学院）;MRS培养基;其他化学试剂均为分析纯。

    2 研究方法

    2.1 灯心草样品采集及处理 灯心草置于50℃鼓风干燥箱干燥，超微粉碎机粉碎过100目筛，备用。

    2.2 液体发酵菌种的制备 将保加利亚乳杆菌和无菌纯水置于超净工作台环境中中充分溶解，用移液枪准确吸取1mL添加到99mL的MRS培养基中，摇匀密封，37℃恒温培养箱培养72h。保加利亚乳杆菌的数量采用平板计数法检测，标准为达到109个/mL。以10%的接菌量再转接到新灭菌的MRS培养基中，密封，37℃恒温培养72h，得到发酵灯心草的液体菌种[3]。

    2.3 灯心草发酵 在无菌环境中，将粉碎烘干后的灯心草粉末准确称取10g份放入250mL的三角瓶中，向事先活化好的菌液中加入无菌蒸馏水100mL，加入MRS培养基，摇匀。接入20mL保加利亚乳杆菌液体发酵菌种，边加边搅拌，将接种后的发酵培养基于恒温培养箱发酵培养7d。

    2.4 灯心草发酵品中总黄酮和多糖的提取 称取一定量经保加利亚乳杆菌发酵的灯心草发酵液体，置于容量瓶中，按不同料液比，加入一定浓度的乙醇，在一定温度和一定时间下超声提取数次。冷却，抽滤，合并滤液，减压抽滤，得到待测液[4]。

    2.5 总黄酮标准曲线绘制和含量测定 以芦丁为标准品，采用亚硝酸钠-硝酸铝-氢氧化钠法测定[5]。以芦丁浓度对吸光值作图，并做线性回归方程。分别向试管中准确量取100ug/mL的芦丁标准溶液0.5、1、1.5、2.0，2.5mL，于10mL容量瓶，再分别加5%的亚硝酸钠溶液0.3mL，充分混匀，静置6min后，再分别加入0.3mL质量分数10%硝酸铝溶液，混匀，静置6min。再分别加入1mol/L氢氧化钠溶液4mL，混匀，定容，放置6min后，在500nm处测定吸光度值。总黄酮的含量测定：采用紫外-可见分光光度法测定总黄酮含量。根据求出的芦丁标品浓度（C）和吸光度值（A）标准曲线的回归方程，分别计算出样品吸光度对应芦丁的浓度，按照如下公式计算灯心草发酵品中总黄酮得率：

    总黄酮含量（%）=（样品浓度×样品定容后的体积/样品的质量）×100

    2.6 多糖标准曲线绘制和含量测定 以葡萄糖为标准品，采用苯酚-硫酸法法测定[6]。以葡糖糖浓度对吸光值作图，并做线性回归方程。配制100μg/mL的葡萄糖标准溶液。分别向5mL容量瓶中准确量取0、0.25、0.5、0.75、1.0、1.25mL的葡萄糖标准溶液，加入0.5mL的5%苯酚溶液，摇匀，迅速加入2.5mL浓硫酸，摇匀，40℃水浴30min后冰水浴放置5min，以相应溶剂为空白，在490nm的波长下测定吸光度值。灯心草发酵品粗多糖含量计算公式如下：

    多糖得率（%）=（样品浓度×样品定容后的体积/样品的质量）×100

    2.7 单因素试验 根据2.4项下试验方法，分别考察不同提取溶剂、乙醇浓度等因素对总黄酮和多糖得率的影响，优选出显著的影响因素。采用综合加权法对数据进行处理，总黄酮得率以5%为最优，多糖得率以10%为最优。试验中总黄酮和多糖得分各占50%，满分为100分。综合得分=总黄酮得率/5%×50+多糖得率/10%×50

    2.8 正交试验 为进一步考察提取工艺，进行正交试验，采用L9（34）正交设计表，进行优化试验[7]。

    3 结果与分析

    3.1 芦丁标准曲线 根据2.5项下的操作，在500nm检测波长下测定，得到回归方程为：Y=0.0146X+0.0179，相关系数R2=0.991。标准曲线如图1所示，芦丁浓度在5～25μg/mL范围内线性关系良好。

    3.2 葡糖糖标准曲线 根据2.6项下的操作，在490nm检测波长下测定，得到回归方程为：Y=0.0207x+0.0909;R2=0.9986。标准曲线如图2所示，葡萄糖浓度在5～25μg/mL范围内线性关系良好。

    3.3 单因素试验结果

    3.3.1 提取溶剂 分别考察乙醇、甲醇、乙酸乙酯、石油醚、水等对总黄酮和多糖的提取工艺的影响，试验结果如表1所示。由表1可知，当提取溶剂为乙醇时，得率最高，因此选择乙醇作为提取溶剂。

    3.3.2 乙醇浓度 分别考察30%、40%、50%、60%、70%的乙醇溶液等对总黄酮和多糖的提取工艺的影响，试验结果如表2所示。由表2可知，乙醇浓度对试验结果影响显著，需要进一步考察。

    3.3.3 料液比 分别考察料液比1∶10、1∶15、1∶20、1∶25和1∶30对总黄酮和多糖的提取工艺的影响，试验结果如表3所示。由表3可知，料液比对试验结果影响显著，需要进一步考察。

    3.3.4 提取次数 分别考察400W超声波提取1、2、3、4次对总黄酮和多糖的提取工艺的影响，试验结果如表4所示。综合考虑，超声提取次数为3次。

    3.3.5 超声提取时间 分别考察400W超声提取10min、20min、30min和40min对总黄酮和多糖的提取工艺的影响，试验结果如表5所示。由表5可知，超声时间对试验结果影响显著，需要进一步考察。

    3.3.6 超声功率考察 分别考察300W、400W、500W、600W等超声频率对总黄酮和多糖的提取工艺的影响，试验结果如表6所示。由表6可知，超声频率对试验结果影响显著，需要进一步考察。

    3.4 正交试验结果 经单因素试验确定了乙醇浓度（A）、料液比（B）、超声提取时间（C）、超声功率（D）等4个因素进行正交试验设计，因素水平表如表7所示，正交试验结果如表8所示，方差分析见表9。

    由表8和表9可知，各因素对总黄酮提取率的影响程度依次为A>B>C>D，其中A因素影响显著，超声提取功率影响最不显著。最佳提取工艺为A2B2C3D2，即50%乙醇提取，料液比为1∶25、超声提取时间为40min、超声提取功率为500W。

    按照上述确定的最佳条件，做3次平行实验，总黄酮平均提取率为4.65%，多糖得率为7.41%，综合得分为83.55，比正交试验表中的任何组合的得率都高。进一步说明正交试验所得的最佳条件是提取灯心草发酵液较为理想的工艺。

    4 讨论

    实验操作过程中，将灯心草制成发酵品是关键的一步，一定要在严格的无菌环境下进行，为了提高提取效果，药材应尽量粉碎。

    临床上灯心草水煎后服用具有镇静安神、消除水肿等作用，保加利亚乳杆菌作为一种乳酸菌，具有促进肠道益生菌恢复等多种作用。本研究通过保加利亚乳杆菌对灯心草发酵，探讨发酵过程对灯心草中总黄酮和多糖的影响，下一步将进行灯心草发酵前后有效成分的比较研究，探讨发酵的作用机制。

    近年来，人们热衷于天然药用植物的开发，其中植物黄酮是研究的热点之一。黄酮是一大类天然产物，具有消炎、镇痛、抗过敏，抑菌、抗病毒、免疫调节、降尿酸、抗肿瘤等作用[8]。将中草药进行发酵，可以提高其有效成分的得率，而微生物发酵中草药在临床应用上具有重要的研究意义与价值。

    5 结论

    采用保加利亚乳杆菌发酵传统中草药灯心草，以灯心草发酵液为研究对象，采用超声波法对发酵品中总黄酮和多糖进行提取。在单因素试验的基础上，进行正交试验，以获得灯心草发酵液中总黄酮和多糖的最佳提取工艺条件，结果表明：在乙醇浓度为50%、料液比为1∶25、超声提取时间为40min、超声提取功率为500W的工艺条件下，灯心草发酵液中总黄酮的最佳得率为4.65%，多糖的最佳得率为7.41%，提取工艺最为理想。

    参考文献

    [1]吴栋，孙彩玲.中药灯心草的中药学研究概况[J].中国实用医药，2015，10（14）：288-289.

    [2]劉佳奇，彭珍，熊涛.乳酸菌发酵对红茶饮料营养成分、香气成分及抗氧化活性的影响[J].食品科学，2017，38（24）：130-136.

    [3]马伟，贾艳姝，刘秀波，等.药用植物黄芪乳酸发酵成分[J].东北林业大学学报，2013，41（01）：129-132.

    [4]张志国，闫立地，梁彦涛，等.正交试验联合星点设计-效应面法优化酸模叶蓼总黄酮的提取工艺研究[J].黑龙江畜牧兽医，2017（21）：210-213.

    [5]唐健民，朱成豪，高丽梅，等.响应面法优化多穗石柯总黄酮提取工艺及抗氧化活性研究[J].安徽农业科学，2020，48（01）：181-185.

    [6]唐秀丽.枸杞多糖的分级及其细胞凋亡诱导活性研究[D].天津：天津科技大学，2013.

    [7]侯金佐，赵蕊，刘玉鹏，等.马齿苋黄酮类化合物的提取及活性研究综述[J].安徽农学通报，2019，25（01）：30-33.

    [8]张丽芳，林霞，冯星海，等.超声辅助有机溶剂回流提取水飞蓟籽中水飞蓟素工艺的优化[J].中成药，2019，41（01）：185-188.

    （责编：张宏民）