基于固相微萃取箭型-气相色谱-质谱法测定铜绿微囊藻中挥发性代谢物

    虞锐鹏 王利平 赵晨凯 吴胜芳 宋启军

    

    

    

    摘?要?建立了顶空-固相微萃取箭型-气相色谱-质谱（HS-SPME Arrow-GC-MS）联用技术，结合多变量统计分析铜绿微囊藻在模拟自然环境条件下，其挥发性代谢物组成及变化规律。通过选取合适萃取头，对不同时期铜绿微囊藻样品中挥发性代谢物进行定性分析，鉴定了210种挥发性代谢物。采用多变量统计分析方法，进一步研究铜绿微囊藻生长过程中挥发性代谢物的消长变化规律，筛选出10种统计学显著性差异代谢物：环己醇、二甲基三硫、苯甲醇、樟脑、2-甲氧基苯酚、3-己烯-1-醇、2，4-癸二烯醛、吲哚、柠檬醛和正壬醇。优化了萃取温度、萃取时间、体系盐度等SPME Arrow萃取条件，筛选差异性代谢物的特征离子峰，并进行定量分析和方法学验证。结果表明，10种统计学显著性差异代谢物在0.050～1000 ng/L范围内具有良好的线性关系，相关系数>0.998，检出限范围为0.010～0.030 ng/L，回收率在76.3%～93.0%之间，RSD≤12.7%（n=6）。本方法操作简便、快速，灵敏度高，稳定性好，可用于蓝藻水华爆发初期天然水体中挥发性代谢标志物测定。

    关键词?顶空-固相微萃取箭型;气相色谱-质谱联用;多变量统计分析;铜绿微囊藻;挥发性代谢物

    1?引 言

    随着湖泊流域人类活动的加剧，大量的营养盐通过各种途径进入水体，造成藻过度繁殖，并于水体表面大量聚集，形成藻类水华[1]。藻类大量死亡时，将细胞内藻毒素及大量代谢物释放到水中，严重恶化水质，散发异味。另一方面，藻类正常生长时也会产生大量的挥发性有机化合物（VOCs），其作为信号物质在水域生态系统中进行信息传递，或有利于释放者在激烈的竞争环境中生存与繁衍[2，3]。藻类VOCs主要为醇类、醛类、酯类、萜类、硫化合物和脂肪族烃[4]。因为极低的气味阈值和令人讨厌的泥土味/霉味，水体中的2-甲基异莰醇和土臭素被广泛检测[5];萜类VOCs因同时具有提高藻细胞抵抗逆境胁迫的能力和化感抑制作用，有利于藻细胞在逆境胁迫中生存和繁殖，并能有效抑制其它水生生物生长[6];烷基硫化物与藻体死亡的关系[7]等一系列挥发性代谢物对环境影响的研究备受关注。如何将水华预警指标细化，将藻类生长繁殖过程中产生的代谢物同传统水体表征指标相结合，建立合理评价指标及水华预测模型，是需要研究者深入探索的方向。

    固相微萃取（SPME）技术，作为水蒸汽蒸馏的替代和补充工具，用于富集挥发性有机化合物，已成为环境、食品和临床分析中广泛使用的萃取技术之一[8，9]。SPME具有省时、高效、不需要使用溶剂和具有一定特异性吸附等特性，但也存在机械稳定性差、萃取头吸附相体积小等缺点。固相微萃取箭型（SPME Arrow）作为固相微萃取领域的一项新技术，其顶部采用更好的保护吸附材料，易于穿刺，具有富集效率高、再现性好、自动化程度高等优点。Helin等[10]采用顶空SPME Arrow测定环境空气和废水中挥发性低分子量烷基胺。Kremser等[11]将SPME Arrow直接浸泡在实验室水和地下水中提取多环芳烃，方法检出限可达50 ng/L;与传统的SPME纤维头和搅拌棒吸附萃取（SBSE）相比，萃取率更高。Castro等[12]将SPME Arrow应用于鱼类样品中人工合成麝香的检测，在这种复杂基质中检出限达到0.5 ng/g。

    針对我国有害蓝藻水华优势藻种中挥发性有机化合物复杂和低含量的特点，本研究采用HS-SPME Arrow GC-MS联用技术，对不同生长时期的铜绿微囊藻（Microcystis aeruginosa，M. aeruginosa）样进行分析，采用多变量统计分析方法，研究其挥发性代谢物的消长变化规律，筛选出10种统计学显著性差异代谢物，建立了主要代谢物的高灵敏度定量分析方法，为评价水环境质量和藻水华预警预报提供了一种可靠的监测手段。

    2?实验部分

    2.1?仪器与试剂

    LECO Pegasus BT气相色谱-飞行时间质谱仪系统（美国LECO公司）;PAL RTC 自动进样系统及孵化炉和加热搅拌模块（瑞士CTC Analytics AG公司）;固相微萃取头： 120 μm divinylbenzene/carboxen/polydimethyl-?siloxane （DVB/CAR/PDMS）、120 μm DVB/PDMS、120 μm CAR/PDMS、100 μm PDMS、100 μm Polyacrylate（PAL SPME Arrow，瑞士CTC Analytics AG公司）;50/30 μm DVB/CAR/PDMS （SPME，美国Supelco公司）;Milli-Q Direct 8纯水仪（美国Millipore公司）;20 mL顶空瓶（德国Gerstel公司） 。

    内标： 氘代吡啶（99.5%，德国Dr公司）;NaCl（优级纯，在450℃烘干6 h 后使用）;甲醇（色谱纯，美国天地公司）;其它化学品 （纯度≥98%）购于安谱公司。

    混合标准溶液： 配制浓度为10 mg/L混合标准物（环己醇、 二甲基三硫、 苯甲醇、 樟脑、 2-甲氧基苯酚、 3-己烯-1-醇、 柠檬醛、 2，4-癸二烯醛、 吲哚、 正壬醇）储备液，用甲醇逐级稀释成10 μg/L标准溶液。顶空标准混合溶液： 向纯水中添加适量标准溶液和内标物，配制成浓度分别为1、 10、 100和1000 ng/L含有10 ng/L内标物的标准混合溶液。

    2.2?样品前处理方法

    藻样采集： 2018年 5月在太湖梅梁湾采集铜绿微囊藻，并经显微镜观察、鉴定。将藻水样放入光照培养箱培养： 温度25℃，光照强度6000 Linux，光暗比12 h∶12 h，扩大培养7 d，到达对数生长期，取对数生长期的纯藻接种。显微镜每日观察藻类生长状况。样品每隔一日采集： 分别为A、B、C、D、E、F、G 7个实验组（后同）。每组各取6个平行样，迅速液氮冷冻，80℃保存。进样前，在25℃恒温水浴中单独解冻10 min，恢复到室温[13]。质量控制（QC） 样品制备： 将所有样品取等体积混匀后，按照上述方法进行相同处理，得到QC样品。

    水样采集及处理： 于水体表面0.5 m下采集，藻密度： 1.0×106～8.0×106/L，过0.45 μm 滤膜后，于20℃保存。

    2.3?固相微萃取方法

    在顶空瓶内加入8 mL藻水样。进样模式： SPME Arrow;萃取温度30℃;萃取时间30 min;解析时间3 min;解析温度250℃;老化时间3 min。

    2.4?GC-MS分析条件

    安捷伦7890B气相色谱条件：DB-5 MS色谱柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）。程序升温：初始温度40℃，保持2 min;以10℃/min升至250℃，保持6 min。传输线温度： 280℃;离子源温度： 210℃;质量扫描范围： 33～400 amu;载气He（99.999%），恒流模式，流速： 1.0 mL/min;不分流进样。随机安排样本进行顺序，每隔8个样品加入1个QC样品检测。

    2.5?数据处理

    化合物定性分析： 经LECO软件自动解卷积处理总离子流图。经NIST2014和Wiley9谱库相匹配，要求正反匹配度均大于800（最大值为1000）。在相同色谱条件下，利用正构烷烃（C6～C26） 计算保留指数，同谱库标准值检索对比。采用峰面积归一化法计算化合物的相对含量。

    差异性代谢物定量分析： 利用内标标准曲线法对筛选得到的差异代谢物进行定量分析。

    2.6?多元统计分析

    采用 SIMCA-P 15.0、Metabo Analyst 4.0对数据集进行主成分分析（Principal component analysis，PCA）、偏最小二乘判别分析（Partial least squares-discriminant analysis，PLS-DA）、层次聚类和变量排序等多元分析，并使用置换策略进行了模型评估。

    3?结果与讨论

    3.1?差异代谢物的筛选

    3.1.1纤维涂层选择?选用不同萃取纤维涂层分别萃取铜绿微囊藻样品（不同时期藻样等量混匀）3次。考察了5种SPME Arrow萃取头对铜绿微囊藻挥发性有机物的影响（图1中A～E），以出峰个数和总峰面积作为萃取能力的主要考察指标。结果表明，选择DVB/CAR/PDMS萃取头时目标物萃取效率最高，出峰数量最大，总峰面积是其它4种萃取头的1.62～8.50倍。DVB/CAR/PDMS外层是PDMS/DVB，内层是CAR/PDMS，具有分子筛选能力。小分子先通过DVB涂层，吸附于内层CAR上，而大分子则被吸附于外层DVB表面[14]，能兼顾各类化合物，对复杂天然挥发性有机化合物有更大的优势。其它4种涂层对分子的大小、极性强弱各有偏重，不适于本研究中种类复杂、变化差异大的藻类代谢物。后续实验均采用DVB/CAR/PDMS。

    萃取相同铜绿微囊藻样品，SPME Arrow是普通SPME（两者均为DVB/CAR/PDMS） 的1.32和1.80倍（图中1A和F）。SPME Arrow吸附相具有更大的表面积和体积，灵敏度更高，适合痕量有机物的富集。

    3.1.2?稳定性评估?为了考察分析方法的稳定性，待色谱条件稳定后，在GC-MS分析序列中每隔8个样本加入1个QC样品。对QC样品进行PCA分析（图2），所有QC样品均在2倍标准偏差（SD）范围内，说明本方法重复性好，能够满足代谢组学的分析要求。

    实验过程中确保实验条件一致，包括藻的培养、留取样品、低温保存、快速解冻、SPME Arrow吸附浓缩、GC/MS进样及分离检测。结果表明，GC-MS总离子流图中95%以上的共有峰峰面积相对标准偏差（RSD）均小于15%，说明本分析方法可靠、稳定，能确保不同样本之间的差别不是由分析方法的误差产生，而是主要来自样本本身的差异。

    化合物定性处理后，共鉴定出210种代谢物，用于进一步的多元统计分析，其中包括醇类28种、醛类23种、酮类27种、酯类24种、萜烯类19种、脂肪族烃36种、硫化物11种、芳香族化合物16种。在生长中期检测到己醛和己醇，通常认为此类C6绿色挥发物（C6 green leaf volatiles）仅在高等植物受损伤时释放[15]。

    3.1.3?PCA模型和PLS-DA模型?PCA作为非监督统计方法，用于查看样本之间的分布趋势。对HS-SPME Arrow-GC-MS 采集得到的不同生长时期铜绿微囊藻数据进行PCA，图 3为PCA模型的可视化得分图。由PCA结果可知，A、B与C组离得更近，D、E、F和G组离得更近，代谢轮廓存在重叠，后4组明显偏离前3组，表明铜绿微囊藻在第四生长时期时生长代谢出现明显变化。然而，第一和第二主成分只贡献了总变异的 32.3%，主要是所选择的7个不同生长周期的铜绿微囊藻产生的挥发性化合物种类变异复杂。因此，不能仅用简单降维处理的样品代替整个样品，需更多的分析以佐证铜绿微囊藻挥发性成分的变化规律。

    PLS-DA作为有监督的方法，用于多类分类判别分析时性能稳健，可以减少变量间多重共线性产生的影响。图4显示PLS-DA模型变量投影重要度（Variable importance projection，VIP）值大于1.5，并结合t检验的p值（阈值≤0.05）获得差异性化合物30种，R2=0.983，Q2=0.936，用R2和Q2交叉验证评价，说明此拟合质量佳，可用于辅助标志代谢物的筛选。

    3.1.4?热图分析?使用热图对7个实验組之间的相关性进行了分析。图 5展示的是前30个皮尔逊分层聚类 p<0.05的代谢物，p值的计算使用单因素方差分析（One-way ANOVA）。红色表示较高的强度，黑色表示中等强度，绿色表示较低强度。在不同生长阶段，各类挥发性成分的释放规律不同;2，4-癸二烯醛、柠檬醛和2-甲氧基苯酚在初期达到最大值，随着生长呈现逐渐降低的趋势;3-己烯-1-醇和2，4-二噻戊烷浓度由低到高，又逐渐降低;而二甲基三硫、丙酮、苯甲醇、3-甲基吲哚和辛醛的浓度则持续稳步升高。聚类热图分析显示，实验组A、B、C接近，而实验组D、E、F、G更为接近，同PCA结论一致。

    对于多组分析，于Anova前50种化合物 （f>10，p<0.01），结合PLS-DA统计结果，从其中筛选出10种统计学显著性差异代谢物： 环己醇、二甲基三硫、苯甲醇、樟脑、2-甲氧基苯酚、3-己烯-1-醇、2，4-癸二烯醛、吲哚、柠檬醛和正壬醇，加以关注。

    3.2?差异代谢物的定量分析

    SPME Arrow相比以往的SPME具有更大的表面积和灵敏度，样品通量提高2倍以上，萃取速度更快。 为使其快速、高效富集目标物，并确保萃取稳定性，需对萃取条件进行优化[16]。

    3.2.1?空白实验

    针对铜绿微囊藻挥发性代谢物分析中样品前处理、测定等环节可能受到的污染，干净顶空瓶需保持在120℃烘干1 h。SPME Arrow进样后，保持250℃下解析3 min使样品完全进入仪器。为尽量减少残留，可适当提高温度，继续老化3 min。以纯水作为空白，进行HS-SPME Arrow-GC-MS进样分析。结果表明，10种差异代谢物均未检出，满足分析要求。

    3.2.2?萃取温度?提高萃取温度可以减少达到平衡所需的时间。然而温度对萃取具有动力学和热力学双重影响： 温度升高，分析物扩散速度加快，有利于缩短衡时间[17];另一方面，升温使分析物在涂层和样品中的分配系数减小，灵敏度降低。考察了3种温度（25℃、30℃和35℃）的影响。由图6可见，随着温度从25℃增加到30℃，萃取效率明显增加，而继续增加到35℃，萃取效率升高幅度不大，樟脑和2，4-癸二烯醛略有降低。 特别是浓度最高的二甲基三硫，随温度升高，萃取效率持续降低。这主要是因其极易挥发，温度升高会导致其在涂层的分配系数降低。另一方面，为了避免温度高于35℃时分析物发生分解和相互转化的可能性，选择萃取温度为30℃（注： 二甲基三硫、2-甲氧基苯酚、2，4-癸二烯醛和吲哚实际量为图中所示10倍，下同）。

    3.2.3?萃取时间和盐分的影响?SPME Arrow基于待测物在涂层和样品基质间分配平衡。理想情况下，应在选择提取时间内使所有分析物达到平衡。

    然而，沸点较高、非极性和弱极性的分析物，平衡时间较长，而且样品中共存组分存在竞争吸附，故可选取在非平衡态下较短的时间内萃取。萃取时间对萃取效率影响如图7所示，30 min后，萃取效率不再明显提高。本研究选择萃取时间为30 min，以期达到萃取效率和萃取时间的最佳结合。

    除萃取时间、温度必须严格控制，确保良好的精密度外，体系盐度也是影响SPME Arrow萃取效率的因素。盐析作用可降低疏水物质在水中的溶解度，增加其在顶空中的含量，提高灵敏度。但盐度过大，可能会增加溶液的粘稠度，延长达到平衡的时间[18]。考察了盐度对SPME Arrow 萃取效率的影响。平行量取 8 mL 水样，分别加入0、0.5、1.0、1.5、2.0和2.5 g NaCl，发现在加入2.0 g NaCl时萃取量最大，但总萃取量仅增长小于15%，说明盐析效应对这10种化合物萃取效率不显著。本实验选择不添加NaCl。

    3.3?线性范围、检出限和精密度

    配制浓度分别为1、10、100、1000 ng/L的系列顶空标准混合溶液，在上述优化条件下进行测定，绘制标准曲线。各目标化合物在0.050～1000 ng/L 范围内线性关系良好。检出限（LOD）以3倍信噪比（S/N） 计算，采用本方法对浓度为 100 ng/L 的混标样品进行 6次平行测试，日内相对标准偏差小于7.1%，日间相对标准偏差小于12.7%。本方法的线性方程、相关系数及检出限见表1。

    3.4?实际样品分析

    采用本方法对太湖梅梁湾表层水源水进行测定。2019年4月水样中铜绿微囊藻密度为1.0×106/L，各化合物浓度如表2所示，加标回收率在 76.3%～93.0%之间，表明基质对本方法的影响较小，本方法可用于实际水样的测定。6周后，在同一水域采样，藻密度为8.0×106/L，3-己烯-1-醇、环己醇、正壬醇、二甲基三硫、吲哚浓度明显增高，提高了15～230倍。此时水体尚未达到轻度水华。后续研究中，可以采用本方法监测藻类代谢物的组成及浓度变化，为建立藻类水华预测模型提供基础数据。

    4?结 论

    建立了顶空-固相微萃取箭型-气相色谱-质谱联用技术，测定不同时期铜绿微囊藻中挥发性代谢物。结合多变量统计分析方法，筛选出10种统计学显著性差异代谢物并定量分析，此方法简便、快捷、可自动化运行，结果准确，为研究藻类代谢物的变化规律和藻类水华预警预报提供了可靠的监测手段。

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